哺乳动物细胞受到人巨细胞病毒(HCMV)感染后释放的包含融合蛋白的病毒颗粒及其应用制造技术

本发明专利技术涉及哺乳动物细胞受到人巨细胞病毒(HCMV)感染后释放的病毒颗粒，其中a)所述颗粒被其中内嵌病毒糖蛋白的脂膜围绕，b)所述颗粒不含病毒DNA和壳体；且c)所述颗粒包含融合蛋白，所述融合蛋白包括T细胞抗原pp65的一个或多个部分以及至少一种异源肽，且其中所述至少一种异源肽被插入至T细胞抗原pp65的氨基酸序列的氨基酸位点W175或A534处。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】本专利技术涉及哺乳动物细胞受到人巨细胞病毒(HCMV)感染后释放的病毒颗粒，其中a)所述颗粒被其中内嵌有病毒糖蛋白的脂膜围绕，b)所述颗粒不含病毒DNA和壳体；且c)所述颗粒包含融合蛋白，所述融合蛋白包括T细胞抗原pp65的一个或多个部分以及至少一种异源肽；且还涉及所述病毒颗粒或多个所述病毒颗粒的应用。受到人巨细胞病毒(HCMV)的感染是在实体器官或造血干细胞移植后患者中疾病的主要原因[1-9]。此外，该病毒在怀孕过程中的传递是西半球新生儿中持久后遗症的最常见原因之一[10；11]。因此，开发HCMV疫苗已经被确定为高优先级目标[12]。这样的疫苗的一个目的应该是预防母体中感染或，至少预防跨胎盘传递。认为中和抗体的诱导对于实现该目的是必要的。相反，防止移植接受者中感染的再激活和控制被认为是通过，特别地由CD8T细胞介导的细胞应答提供[13-15]。移植接受者的治疗性疫苗接种，其引起淋巴细胞应答，可能与过继T细胞转移组合，将对于改善移植后时期内HCMV病毒再激活结果是理想的[16]。尽管存在开发HCMV疫苗的有前景的方法，但是仍然不存在许可的制剂可用[10；17-19]。由众多关于提供保护的免疫效应器的研究，似乎证明了针对HCMV的理想疫苗应该诱导抗病毒中和抗体和T淋巴细胞二者[10；17；18；38]。然而，存在这样的担忧，即究竟是否可以构建这样的通用HCMV疫苗。近期临床研究显示：表达HCMV蛋白的α病毒复制子是被充分耐受的并诱导持续的细胞和体液应答[19]。另一项研究使用纯化的gB作为疫苗并提供鼓舞人心的结果，因为可以诱导显著水平的HCMV中和抗体[18]。这些疫苗有希望用于预防先天性HCMV感染。在以前小鼠中的研究中，所谓的密体，其在本文中也称为DB，被证实具有出人意料的免疫原性[20]。如本领域中一般理解地和如本文中也使用地，密体是哺乳动物细胞受到人巨细胞病毒(HCMV)感染后释放的病毒颗粒，其中a)所述颗粒被其中内嵌有病毒糖蛋白的脂膜围绕，b)所述颗粒不含病毒DNA和壳体。优选地，这样的密体还包含融合蛋白，所述融合蛋白包括T细胞抗原pp65的一个或多个部分以及至少一种异源肽。密体及其制备也记述在国际专利申请WO 00/53729中。由于它们出人意料的免疫原性，所以努力开发DB作为HCMV疫苗。近期的实验提供实验证据证明DB可以在其抗原含量(antigenic content)方面改进[21；22]。这是通过由重组HCMV表达融合蛋白实现，所述融合蛋白由主要DB-成分pp65和来自病毒IE1-蛋白的异源MHC类别I呈递肽。这导致在感染的人包皮成纤维细胞(HFF)中形成重组DB(recDB)。包含融合蛋白的recDB由感染的HFF释放[21]。将这些颗粒应用于HLA-A2转基因HHD-小鼠诱导了CD8+T淋巴细胞应答，这在分离的T细胞的体外肽刺激后变得明显[22]。然而，当通过Elispot分析直接离体(ex vivo)测试CD8+T细胞级分时，不能立即检测到HCMV特异性T细胞。这说明尽管原则上适合于治疗性应用，但是使用这些颗粒时引发(priming)不如所需的那么显著。此外，来自感染的HFF培养物的这些recDB的产率低。因此，本专利技术涉及的问题是提供适合于作为疫苗的病毒密体，其中所述病毒密体包含融合蛋白，所述融合蛋白包括T细胞抗原pp65的一个或多个部分以及至少一种异源肽，且其中优选地，所述疫苗能够引发针对所述至少一种异源肽的免疫应答。本专利技术涉及的另一个问题是提供病毒密体，其中所述病毒密体包含融合蛋白，所述融合蛋白包括T细胞抗原pp65的一个或多个部分以及至少一种异源肽，且其中优选地，所述密体能够诱导中和抗体的形成和/或CD8+T淋巴细胞应答。本专利技术涉及的另一个问题是提供病毒密体，其中所述病毒密体包含融合蛋白，所述融合蛋白包括T细胞抗原pp65的一个或多个部分以及至少一种异源肽，且其中所述密体可以以高产率制备。这些和其他问题通过所附独立权利要求的主题解决。优选的实施方案可以获自同样后附的从属权利要求。更明确地，本专利技术涉及的问题在第一方面(其也是所述第一方面的第一实施方案)中，通过哺乳动物细胞受到人巨细胞病毒(HCMV)感染后释放的病毒颗粒来解决，其中a)所述颗粒被其中内嵌有病毒糖蛋白的脂膜围绕，b)所述颗粒不含病毒DNA和壳体；且c)所述颗粒包含融合蛋白，所述融合蛋白包括T细胞抗原pp65的一个或多个部分以及至少一种异源肽，且其中所述至少一种异源肽被插入至T细胞抗原pp65的氨基酸序列的氨基酸位点W175或A534处。在所述第一方面的第二实施方案(其也是所述第一方面的第一实施方案的实施方案)中，所述至少一种异源肽被插入至T细胞抗原pp65的氨基酸序列的氨基酸位点W175处。在所述第一方面的第三实施方案(其也是所述第一方面的第一和第二实施方案的实施方案)中，所述T细胞抗原pp65的氨基酸序列包含根据SEQ ID NO：1的氨基酸序列。在所述第一方面的第四实施方案(其也是所述第一方面的第一、第二和第三实施方案的实施方案)中，所述颗粒是高度抗原性的。在所述第一方面的第五实施方案(其也是所述第一方面的第一、第二、第三和第四实施方案的实施方案)中，所述颗粒能够诱导中和抗体的形成。在所述第一方面的第六实施方案(其也是所述第一方面的第一、第二、第三、第四和第五实施方案的实施方案)中，所述颗粒能够诱导CD8+T淋巴细胞应答。在所述第一方面的第七实施方案(其也是所述第一方面的第一、第二、第三、第四、第五和第六实施方案的实施方案)中，所述至少一种异源肽是MHC类别I呈递抗原。在所述第一方面的第八实施方案(其也是所述第一方面的第一、第二、第三、第四、第五、第六和第七实施方案的实施方案)中，所述至少一种异源肽包括一种或多种与pp65不同的蛋白的一个或多个部分或由一种或多种与pp65不同的蛋白的一个或多个部分形成。在所述第一方面的第九实施方案(其也是所述第一方面的第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七和第八实施方案的实施方案)中，所述至少一种异源肽包括HCMV糖蛋白的一个或多个部分或是HCMV糖蛋白的一个或多个部分。在所述第一方面的第十实施方案(其也是所述第一方面的第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八和第九实施方案的实施方案)中，所述至少一种异源肽包括本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2010.04.06 EP 10003712.61.哺乳动物细胞受到人巨细胞病毒(HCMV)感染后释放的病毒颗粒，
其中
a)所述颗粒被脂膜围绕，在所述脂膜中内嵌有病毒糖蛋白，
b)所述颗粒不含病毒DNA和壳体；且
c)所述颗粒包含融合蛋白，所述融合蛋白包括T细胞抗原pp65的一
个或多个部分以及至少一种异源肽，
且其中所述至少一种异源肽被插入至T细胞抗原pp65的氨基酸序列
的氨基酸位点W175或A534处。
2.根据权利要求1所述的病毒颗粒，其中所述至少一种异源肽被插入
至T细胞抗原pp65的氨基酸序列的氨基酸位点W175处。
3.根据权利要求1至2中任一项所述的病毒颗粒，其中所述T细胞抗
原pp65的氨基酸序列包含根据SEQ ID NO：1的氨基酸序列。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的病毒颗粒，其中所述颗粒是高
度抗原性的。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的病毒颗粒，其中所述颗粒能够
诱导中和抗体的形成。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的病毒颗粒，其中所述颗粒能够
诱导CD8+T淋巴细胞应答。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的病毒颗粒，其中所述至少一种
异源肽是MHC类别I呈递抗原。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的病毒颗粒，其中所述至少一种
异源肽包括一种或多种与pp65不同的蛋白的一个或多个部分或由一种或
多种与pp65不同的蛋白的一个或多个部分形成。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的病毒颗粒，其中所述至少一种
异源肽包括HCMV糖蛋白的一个或多个部分或是HCMV糖蛋白的一个或
多个部分。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的病毒颗粒，其中所述至少一
种异源肽包括HCMV糖蛋白gB的一个或多个部分或是HCMV糖蛋白gB

\t的一个或多个部分。
11.根据权利要求1至9中任一项所述的病毒颗粒，其中所述至少一
种异源肽包括HCMV糖蛋白gH的一个或多个部分或是HCMV糖蛋白gH
的一个或多个部分。
12.根据权利要求1至9中任一项所述的病毒颗粒，其中所述至少一
种异源肽包括至少两种HCMV糖蛋白或由至少两种HCMV糖蛋白组成，
所述至少两种HCMV糖蛋白是来自不同HCMV毒株的特定糖蛋白的变体。
13.根据权利要求12所述的病毒颗粒，其中所述特定糖蛋白的至少两
种变体中的一种是HCMV Towne毒株的变体且所述特定糖蛋白的至少两
种变体中另一种是HCMVAd169毒株的变体。
14.根据权利要求12至13中任一项所述的病毒颗粒，其中所述糖蛋
白是HCMV的gB蛋白。
15.根据权利要求1至8中任...

【专利技术属性】
技术研发人员：扎比内·贝克，扎比内·雷达，博多·普拉赫特，
申请(专利权)人：疫苗工程管理有限公司，
类型：
国别省市：