去细胞化的脂肪组织制造技术

本发明专利技术提供了一种对脂肪组织去细胞化的方法，包括将脂肪组织在含有一种或者多种的酶的酶解液中进行一次或者多次的培养，还有一次或者多次的溶剂萃取，其中，得到了包括三维结构很好保留的胞外基质的去细胞化脂肪组织。本发明专利技术还提供了一种包括三维结构很好保存的胞外基质的去细胞化脂肪组织，和生物支架、微载体珠，和包括去细胞化脂肪组织的涂层。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】相关申请本申请要求享有2009年12月17日申请的美国临时专利No.61/287,236的优先权益，其全部内容在此通过引用被全部纳入本文。
本专利技术涉及一种对脂肪组织进行去细胞化的方法以及去细胞化的脂肪组织，所述去细胞化的脂肪组织具有很好的保留了三维结构的细胞外基质。这种去细胞化脂肪组织适用于生物医学领域，例如在软组织填充中使用或者用做生物支架。不仅如此，在生物反应器或者活体内，这种去细胞化脂肪组织还可以在原始细胞或者细胞株静置培养时被用做细胞培养基底物。
技术介绍
当前临床用于软组织填充的生物材料主要包含自体的、异体的和异质的几种。自体材料的研究兴趣多集中于移植脂肪组织。这种方法比较受欢迎的主要原因是多数病人体内存能够移植的可消耗的脂肪组织，而且抽脂术的出现加速了脂肪采集的过程。然而，游离脂肪的移植产生了一些不令人满意和出乎意料的结果，就是由于缺少提供支持的血管，移植物被不同程度地吸收掉了。总的来说，通过注射自体的脂肪，只有一些小的缺陷能够被纠正，而且这些有限的应用还需要反复的处理以维持脂肪的需求量，因为这些移植的脂肪会逐渐被散布者油脂性囊肿的纤维组织所取代。使用包含皮肤、脂肪和肌肉的带蒂皮瓣进行的自体组织移植需要相当多的外科技巧，但是获得的效果要远远优于合成材料植入物。然而，这种皮瓣的成本很高，这主要与供体部位发病和畸形的情况有关，当然也与住院和手术的时间有关。移植大量的组织也会导致供体部位变得虚弱，尤其是腹部的主要肌肉移植。可注射的自体胶原蛋白可以利用病人自身皮肤的活体切片或者较大样本来进行制备。这种物质使用中会发生移植物被吸收，因而只能起到短暂的填充作用。利用这种方法取得的组织的数量由于在皮肤上产生缺损而受到限制。异体材料主要被用做可注射的填充物在美容方面使用，用量一般比较小，包括脸部的皱纹或者一些小瑕疵。这种材料被临时填充在真皮区域，可以使表层皮肤变得平整光滑。大体上这种材料具有一定的局限性，而且需要反复的、昂贵的治疗方法以达到所需要的效果。从动物(例如牛和猪)体内获取的胶原蛋白类材料在使用时通常会伴随着过敏反应和免疫反应。其实，移植材料被快速吸收也是一个问题，因此在移植的时候推荐加入过量的材料(100-200％)并且需要经过反复的治疗(每3-6个月)来维持所需要的量。胶原蛋白与戊二醛的交联可以提高材料的弹性，还能够降低材料的免疫原性。对病传染的担心限制了异种胶原蛋白来临床上的应用。其他异体材料例如去细胞化的人尸体真皮，富含胶原蛋白、弹性蛋白和葡糖氨基葡聚糖(GAGs)的人类尸体的真皮可以被加工成为可注射的剂型或者做成片状根据实际情况切割成需要的形状。这类材料没有免疫原性而且可以持续使用长达两年，然而当吸收出现也需要按照200％的量过量使用。可以注射的异质材料(包括聚L-乳酸(PLA))已经被证实可以用于治疗艾滋病人的脂肪萎缩。据报道，注射需要进行反复多次，而且会形成明显触摸到的结节。注射用的聚四氟乙烯(PTFE)可以促进形成永久性的填充而不需要反复的治疗。然而，聚四氟乙烯植入物跟软组织相比具有明显不同的机械特性，会从植入点发生移动，这就增加了感染的危险。上面所说的同体的、异体的和异质的软组织填充方法都有一些明显的缺陷。现在出现了一种软组织重建的替代方法，使用的是一种种植细胞的支架。这种支架材料可以是合成的(例如聚乳酸-羟基乙酸、聚羟基乙酸和聚乙二醇二丙烯酸酯)，也可以是纯天然的(例如胶原蛋白、纤维蛋白、透明质酸的衍生物或者丝蛋白)。一般情况下纯天然的支架材料更加受欢迎，但是在使用中有一个潜在的缺点，那就是纯天然的材料在使用前需要经过像去细胞化这样的加工，以使发生免疫原反应的可能性降到最小并且确保长期使用的稳定性。
技术实现思路
这里描述的是一种对脂肪组织进行去脂肪化的方法，该方法包括将脂肪组织在含有一种或者多种的酶的酶解液中进行一次或者多次的培养，还有一次或者多次的溶剂萃取，最终得到了包括三维结构被很好保留的胞外基质的去细胞化脂肪组织。这种很好保留的结构可以包括血管和/或导管结构。得到的胞外基质可能含有纤维状的和网状的胶原蛋白的结合。得到的胞外基质含有IV型蛋白，也可能含有I-III型、V型和VI型胶原蛋白的一种或几种。这种去细胞化脂肪组织还可能包含弹性蛋白和(或)弹性纤维。这种去细胞化脂肪组织可能含有层粘连蛋白或者纤连蛋白，也可能同时包含两种蛋白；可能含有透明质酸或者硫酸软骨素，也可能二者同时含有；可能含有一种或多种蛋白多糖、糖蛋白、糖胺聚糖以及几种物质的任意结合。本方法包括包括一个或者一个以上涉及机械搅拌的步骤，所述一个或者一个以上涉及机械搅拌的步骤可以包含一次或者多次的冷冻-解冻循环、搅拌，或者是二者的结合。一次或者多次的冷冻-解冻循环的过程可以在低渗溶液、高渗溶液或者中性缓冲液中进行。本方法可以包括在冲洗缓冲液中冲洗一次或者多次。本方法可以包括使用至少一种极性溶剂、至少一种非极性溶剂，或者二者的结合。使用本方法可以得到一种基本没有完整的脂肪细胞的去细胞化脂肪组织。按照本方法的实施方案，本专利技术的主题可以包括基本去除了脂肪组织中具有免疫原性的组分。在一个实施方案中，本方法可以包括：(i)在冷冻缓冲液中对脂肪组织进行一次或者多次的冷冻-解冻循环处理；(ii)对脂肪组织进行酶解；(iii)对脂肪组织进行一次或者多次的极性溶剂萃取；(iv)用冲洗缓冲液对脂肪组织进行冲洗；(v)对脂肪组织进行酶解；(vi)用冲洗缓冲液对脂肪组织进行冲洗；(vii)对脂肪组织进行酶解；(viii)用冲洗缓冲液对脂肪组织进行冲洗；(ix)对脂肪组织进行极性溶剂萃取；(x)用冲洗缓冲液对脂肪组织进行冲洗；这里还描述了一从脂肪组织中充分分离细胞外基质材料的方法，包括，将脂肪组织在酶解液中进行一次或多次的培养，经过一次或者多次的溶剂萃取，最后得到了三维结构完好保存的胞外基质材料。本方法可能涉及一步或者多步的机械破碎、一步或者多步的酶解，一次或者多次的缓冲液冲洗，或者还有一步或者多步的极性溶剂萃取。本方法也包含了使用一种或多种非极性溶剂的混合溶剂和一种或多种极性溶剂的混合溶剂对脂肪组织进行萃取。本方法可能涉及去细胞化因子的灌注，目的是为了放大或者加速去细胞化进程本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2009.12.17 US 61/287,2361.一种对脂肪组织去细胞化的方法，包括将脂肪组织在含有一种
或者多种的酶的酶解液中进行一次或者多次的培养，还有一
次或者多次的溶剂萃取，其中，得到了包括三维结构很好保
留的胞外基质的去细胞化脂肪组织。
2.根据权利要求1所述的方法，包括至少使用一种极性溶剂，
至少使用一种非极性溶剂或者二者的结合。
3.根据权利要求1所述的方法，包括涉及机械搅拌的一步或者
多步步骤。
4.根据权利要求1所述的方法，进一步包括将含有一种或者多
种酶的酶解液和(或)一种或者多种极性溶剂的萃取液灌注
到脂肪组织中。
5.根据权利要求4所述的方法，通过给动脉和/或静脉安插套管
对脂肪组织进行灌注。
6.根据权利要求1所述的方法，包括在冲洗液冲洗一次或者多
次。
7.根据权利要求3所述的方法，其中，涉及机械搅拌的一步或
者多步步骤包括冷冻-解冻循环或者搅拌，或者二者的结合。
8.根据权利要求7所述的方法，这里的一次或者多次的冷冻-
解冻循环是在高渗的或者低渗的溶液中进行。
9.根据权利要求1所述的方法，包括：
(i)在冷冻缓冲液中对脂肪组织进行一次或者多次的冷
冻-解冻循环处理；
(ii)对脂肪组织进行酶解；
(iii)对脂肪组织进行一次或者多次的极性溶剂萃取；
(iv)在冲洗缓冲液对脂肪组织进行清洗；
(v)对脂肪组织进行酶解；
(vi)在冲洗缓冲液对脂肪组织进行清洗；
(vii)对脂肪组织进行酶解；
(viii)在冲洗缓冲液对脂肪组织进行清洗；
(ix)对脂肪组织进行极性溶剂萃取；和
(x)在冲洗缓冲液对脂肪组织进行清洗；
10.根据权利要求1所述的方法，这里的去细胞化脂肪组织基本
去除了完整的脂肪细胞。
11.根据权利要求1所述的方法，这里基本去除了脂肪组织中的
免疫原性组分。
12.一种去细胞化脂肪组织，包括一种三维结构完好保存的胞外
基质。
13.根据权利要求12所说的去细胞化脂肪组织，这里获得的去
细胞化脂肪组织基本去除了完整的脂肪细胞。
14.根据权利要求12所说的去细胞化脂肪组织，这里获得的去
细胞化脂肪组织基本不含有免疫原性组分。
15.根据权利要求12所说的去细胞化脂肪组织，这里的胞外基
质含有纤维状和网状胶原的结合。
16.根据权利要求12所说的去细胞化脂肪组织，这里的胞外基
质包含IV型胶原。
17.根据权利要求12所说的去细胞化脂肪组织，这里的胞外基
质包含I到III型、V型和VI型胶原中的一种或几种。
18.根据权利要求12所说的去细胞化脂肪组织，包含层粘连...

【专利技术属性】
技术研发人员：L·E·弗林，
申请(专利权)人：金斯顿女王大学，
类型：
国别省市：