诱导组织再生的方法技术

提供用于从相同谱系的有丝分裂后分化细胞中离体和体内生产谱系内细胞(谱系限制细胞)的方法，和通过使用这些谱系限制细胞治疗需要组织再生治疗的对象的方法。此外，从源自疾病患者的有丝分裂后组织中生产谱系限制细胞可鉴定这些疾病中已经偏离的途径，并可作为一种发现新药的方式用于筛选会改善或校正所述缺陷的药物。还提供用于进行这些方法的试剂盒。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】相关申请的交叉引用根据35U.S.C.§119(e)，本申请要求2009年11月18日提交的美国临时专利申请系列号第61/281,575号的提交日优先权；其内容通过引用纳入本文。政府权利本专利技术由政府支持在国立卫生研究院(National Institutes of Health)的基金号F32 AR051678-01、5T32AI07328、5T32HD007249、AG009521、和AG020961下完成。美国政府享有本专利技术的某些权利。
本专利技术涉及通过从相同谱系的有丝分裂后分化细胞中离体和体内生产谱系内细胞即谱系限制细胞诱导组织再生的方法。还提供用于进行这些方法的试剂盒。专利技术背景人类组织再生非常有限且构成损伤器官功能修复的主要难题。许多器官依赖未分化的干细胞和祖细胞进行组织再生。然而，不清楚驻留的干细胞能否再生特定损伤所需的组织完整体。此外，许多组织尚未鉴定到干细胞，而且在那些鉴定到干细胞的组织中，诱导其增殖和分化以掌握这些组织中细胞命运的因子并没有完全理解。因此，需要有诱导良好定义的已知特征的分化细胞的方法来协助体内细胞替换和组织再生。此外，所述细胞的离体增殖可在体内递送后用作基于细胞的治疗。所述方法还可用于离体模拟人类疾病(例如骨骼、神经元、心脏、胰腺、肝脏疾病等)并阐明潜在缺陷。此外，能改善人类疾病表型的药物可用所述疾病模型筛选。专利技术概述提供从相同谱系的有丝分裂后分化细胞(PMD)中离体和体内生产谱系内细胞即谱系限制细胞(LRC)的方法，其中所述谱系限制细胞可包括定向为细胞谱系的有丝分裂祖细胞(MPC)、定向为所述细胞谱系中的具体细胞类型的有丝分裂后未成熟细胞(有丝分裂后未成熟细胞，PMI)、和所述细胞谱系的有丝分裂后分化细胞(有丝分裂后分化细胞，PMD)。还提供通过使用本专利技术方法生产的细胞治疗需要组织再生疗法的对象的方法。还提供用于进行这些方法的试剂盒。在本专利技术的一些实施方式中，有丝分裂后分化细胞(PMD)与有效量的短暂抑制细胞周期调节剂(即口袋蛋白)的口袋蛋白家族成员活性的试剂，和有效量的短暂抑制细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂2A(CDKNA2)读框替代蛋白(ARF)活性的试剂离体接触。与这些试剂的接触在足以诱导PMD细胞短暂变为可复制型细胞(RCC)并分裂产生非致瘤性后代的条件下发生，所述后代为与PMD相同谱系的有丝分裂后未成熟细胞(PMI)。在一些实施方式中，PMD在变为RCC的过程中去分化。在一些实施方式中，所述PMD为肌细胞如心肌细胞。在一些实施方式中，所述PMD为肝细胞。在一些实施方式中，所述PMD为神经元如多巴胺能神经元。任何包含有丝分裂后细胞的组织(如肌肉、大脑、皮肤、胰腺、肝脏等)包括在本文中。在一些实施方式中，所述口袋蛋白是视网膜母细胞瘤蛋白(RB)。在一些实施方式中，短暂抑制RB活性的试剂暂时抑制RB蛋白的合成。在一些实施方式中，短暂抑制ARF的试剂暂时抑制ARF蛋白的合成。在一些实施方式中，存在于细胞群中约10％的PMD被诱导变为RCC并分裂。在一些实施方式中，后代PMI群以促进分化的条件提供，从而产生所需谱系的PMD群。在某些实施方式中，通过将所述后代移植到对象中的靶位置将后代PMI转移到分化条件中。在一些实施方式中，所述对象为理想地在移植的靶位置需要组织再生治疗的对象。在本专利技术的一些实施方式中，组织中的有丝分裂后分化细胞(PMD)与有效量的短暂抑制细胞周期调节剂(即口袋蛋白)的口袋蛋白家族成员活性的试剂，和有效量的短暂抑制细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂2A(CDKNA2)读框替代蛋白(ARF)活性的试剂体内接触，其中所述接触的PMD被诱导短暂变为可复制型细胞(RCC)并原位分裂产生所述组织谱系的有丝分裂后未成熟细胞(PMI)群。在一些实施方式中，PMD在变为RCC的过程中去分化。在一些实施方式中，所述有丝分裂后分化细胞为肌细胞如心肌细胞。在一些实施方式中，所述PMD为肝细胞。在一些实施方式中，所述PMD为神经元如多巴胺能神经元。任何包含有丝分裂后细胞的组织(如胰腺)包括在本文中。在一些实施方式中，所述口袋蛋白是视网膜母细胞瘤蛋白(RB)。在一些实施方式中，短暂抑制RB活性的试剂暂时抑制RB蛋白的合成。在一些实施方式中，短暂抑制ARF的试剂暂时抑制ARF蛋白的合成。在一些实施方式中，将短暂抑制口袋蛋白活性的试剂和短暂抑制ARF活性的试剂给予对象的靶位置。在一些实施方式中，所述对象为理想地在给予所述试剂的靶位置需要组织再生治疗的对象。在一些实施方式中，所述PMD源自患病个体以表征该疾病(如阿尔茨海默病患者的皮层神经元、帕金森病患者的多巴胺能神经元、和遗传性或获得性心脏病患者的心肌细胞等)。在一些实施方式中，所述PMD源自存活的个体如来自活组织活检的PMD。在一些实施方式中，所述PMD源自已死亡的患者，即PMD来自尸体。在本专利技术的一些方面中，提供根据对疾病条件的影响筛选候选试剂的方法。在这些方法中，用上述方法从来自患病个体的有丝分裂后分化细胞(PMD)产生谱系限制细胞(LRC)。所述LRC转移到促进分化的条件产生分化的细胞群。分化的细胞与候选试剂接触，且分化群中细胞的活力和/或功能与不接触所述候选试剂的分化细胞的活力和/或功能相比较；其中候选试剂接触的分化群中细胞的活力和/或功能相较不接触所述候选试剂的分化群提高，表明所述候选试剂对所述病情会有影响。在一些实施方式中，所述病情是肌肉失调。在一些实施方式中，所述肌肉是平滑肌、骨骼肌或心肌。在一些实施方式中，所述病情是神经系统失调。在一些实施方式中，所述神经系统失调是帕金森病、阿耳茨海默病、ALS、嗅觉神经元失调、脊髓神经元失调、或外周神经元失调。在一些实施方式中，所述PMD来自存活个体。在一些实施方式中，所述PMD来自尸体。在本专利技术的一些方面中，提供根据对人的毒性筛选候选试剂的方法。在这些方法中，用上述主题方法从来自健康个体的有丝分裂后分化细胞(PMD)产生谱系限制细胞(LRC)。所述LRC转移到促进分化的条件产生分化的细胞群。分化的细胞群与候选试剂接触，且分化群中细胞的活力和/或功能与不接触所述候选试剂的分化细胞的活力和/或功能相比较；其中候选试剂接触的分化群中细胞的活力和/或功能相较不接触所述候选试剂的分化群降低，表明所述候选试剂对人有毒性。在一些实施方式中，所述PMD为肝细胞。在一些<本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2009.11.18 US 61/281,5751.一种从相同谱系的有丝分裂后分化细胞(PMD)中产生谱系限制细胞
(LRC)的方法，所述方法包括：
将PMD和有效量的短暂抑制口袋蛋白活性的试剂和有效量的短暂抑制
细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂2A读框替代蛋白(ARF)活性的试剂在
足以使所述PMD短暂分裂产生后代的条件下接触，
其中所述后代为与所述PMD相同谱系的LRC。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述PMD在分裂前去分化。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述PMD是肌细胞。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述肌细胞选自下组：心肌细
胞、平滑肌细胞、骨骼肌细胞和肌纤维。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述口袋蛋白是视网膜母细
胞瘤蛋白(RB)。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述短暂抑制RB活性的试剂
是核酸、多肽或小分子。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述短暂抑制ARF活性的试
剂是核酸、多肽或小分子。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述接触的PMD群中约10％
被诱导短暂分裂。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述PMD来自患病个体。
10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述个体存活。
11.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述个体是尸体。
12.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法体内实现。
13.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法离体实现。
14.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括转移所述后
代LRC到促进分化的条件中，
其中产生的群是与所述接触步骤中接触的PMD相同谱系的PMD群。
15.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述转移通过移植所述后代

\t到对象中实现。
16.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述对象需要组织再生治疗。
17.一种根据对病情的效果筛选候选试剂的方法，所述方法包括：
用权利要求1所述的方法从来自有所述病情的个体的有丝分裂后分化细
胞(PMD)产生谱系限制细胞(LRC)，
转移所述LRC到促进分化的条件以产生分化的细胞群，
将所述分化的细胞群与候选试剂接触，和
将所述分化群中的细胞的活力和/或功能与没有接触所述候选试剂的分化
细胞的活力和/或功能作比较；
其中与所述候选试剂接触的分化群中细胞的活力和/或功能相较不接
触所述候选试剂的分化群提高表明所述候选试剂对所述病情会有影响。
18.如权利要求17所述的方法，其特征在于，所述病情是肌肉失调。
19.如权利要求18所述的方法，其特征...

【专利技术属性】
技术研发人员：H·M·布劳，K·帕西尼，J·波梅兰茨，
申请(专利权)人：小利兰·斯坦福大学托管委员会，
类型：
国别省市：