一种将感兴趣的分子导入具有细胞壁的植物细胞中的方法包括将gamma-玉米醇溶蛋白肽与感兴趣的分子相互作用以形成gamma-玉米醇溶蛋白连接结构。然后，将gamma玉米醇溶蛋白连接结构置于与具有细胞壁的植物细胞的接触中，并容许将gamma玉米醇溶蛋白连接结构摄取入植物细胞中。或者，可以在具有完整细胞壁的植物细胞中表达感兴趣的基因，其通过将gamma-玉米醇溶蛋白肽与感兴趣的分子相互作用以形成gamma-玉米醇溶蛋白连接基因结构，容许将gamma玉米醇溶蛋白连接基因结构摄取入植物细胞中，并在植物细胞及其后代中表达感兴趣的基因。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于将生物分子递送入植物细胞中的植物肽GA圖A-玉米醇溶蛋白优先权要求本申请要求2010年3月31日提交的美国临时专利申请流水号61/319，764的关于“PLANT PEPTIDE GAMMA-ZEIN FOR DELIVERY OF BIOMOLECULES INTO PLANT CELLS” 的提交日权益。
技术介绍
开发展现出特定性状的新植物系的传统植物育种策略是费时的且有时是 不可预测的。现有的策略，诸如土壤杆菌属(Agrobacterium)介导的转化和颗粒轰击很大程度上取决于组织和基因型。细胞穿透肽(CPP)是一类新的且快速增长的短肽，已知其在将一大批包含DNA、RNA和蛋白质的货物复合物易位穿过哺乳动物和人细胞系的生物膜时发挥重要的作用(Schwartz 和 Zhang, 2000; Langel, 2002; Vives, 2002,)。虽然已经显示了 CPP有助于哺乳动物细胞中的货物递送，但是在植物细胞中使用CPP以进行转染的研究受限于许多因素。使此技术适合于植物的主要障碍在于，与动物细胞不同，植物细胞给CPP及其货物的内在化呈现出双重屏障系统(细胞壁和质膜)。因此，CPP必须克服这两种屏障来将货物分子有效移位入完整的植物细胞中。CPP已经在植物细胞中使用，但是依赖于使用透化剂以实现对完整的植物细胞递送货物分子。CPP介导的将小分子、核酸和蛋白质向完整的植物细胞中的递送很大程度上仍然是未探索的，并且对于植物系统中的体外和体内遗传和生物化学操作是有利的。纳米颗粒具有的独特性质已经被利用于将DNA递送至细胞。金属纳米颗粒，诸如金(Au)纳米颗粒由于其低细胞毒性和容易用各种有生物学意义的配体官能化而已经用于DNA递送。在金属纳米颗粒外,还已经使用大小范围3-5nm内的半导体纳米颗粒(例如量子点)(“QD”)作为载体来将分子递送到细胞中。DNA和蛋白质可以连接经由各种表面官能化附接于 QD 的配体(见例如 Patolsky, F.等，J. Am. Chem. Soc. 125，13918 (2003))。已经使用纳米颗粒来将质粒DNA递送到多种动物细胞。已经发现了，在将经DNA包被的纳米颗粒与没有细胞壁的细胞一起温育时，细胞吸收纳米颗粒，并开始表达DNA上编码的任何基因。然而，由于植物细胞壁的存在，当前的植物基因递送是挑战性的，这导致对用于植物遗传转化的侵入性递送手段的常见依赖。在期望对通常具有细胞壁的细胞进行纳米颗粒介导的递送的情况中，在将颗粒添加至植物原生质体前将细胞壁剥离(见Torney, F.等，Nature Nanotechnol. 2, (2007))。在植物细胞中，细胞壁给递送外源施用的分子呈现难以克服的障碍。已经采用许多侵入性方法，如基因枪(生物射弹)、显微注射、电穿孔、和土壤杆菌来实现向有壁的植物细胞中的基因和小分子递送，但是仅仅通过显微注射实现了蛋白质递送。随着来自植物基因组测序项目的信息日益增多，迫切需要用于一大批基因的功能基因组研究及用于开发表达重要的农艺学性状的转基因植物的在植物中的快速、通用的(不依赖组织/基因型的)方法。专利技术概述以下结合系统、工具和方法来描述各实施方案，所述系统、工具和方法意为例示性和说明性，而非对范围的限制。本专利技术的一个实施方案涉及一种将感兴趣的分子导入具有细胞壁的植物细胞中的方法。该方法包括提供具有细胞壁的植物细胞，并将ga_a-玉米醇溶蛋白肽与感兴趣的分子相互作用以形成gamma-玉米醇溶蛋白连接结构。然后,将所述具有细胞壁的细胞和所述gamma-玉米醇溶蛋白连接结构置于彼此接触中，并容许将gamma-玉米醇溶蛋白连接的感兴趣的分子摄取入所述具有细胞壁的细胞中。本专利技术的另一个实施方案涉及一种表达基因的方法，该方法包括提供具有细胞壁的植物细胞，并将gamma-玉米醇溶蛋白肽与感兴趣的基因相互作用以形成gamma-玉米醇溶蛋白连接基因结构。将具有细胞壁的植物细胞和ga_a-玉米醇溶蛋白连接结构置于彼此接触中，并容许将gamma-玉米醇溶蛋白和基因摄取入包含细胞壁的植物细胞中。然后，表达具有植物细胞的植物的后代中的基因。在本专利技术的又一个实施方案中，将分子物质转移入植物细胞中。该方法包括将 gamma-玉米醇溶蛋白肽与质粒DNA相互作用以形成gamma-玉米醇溶蛋白连接结构。在容许将gamma-玉米醇溶蛋白肽和来自质粒DNA的基因摄取入植物细胞中的条件下使所述gamma-玉米醇溶蛋白连接结构与携带完整壁的植物细胞置于接触中。在上文所描述的例示性方面和实施方案外，其它方面和实施方案会因以下描述而变得显而易见。附图简述图I显示了 gamma-玉米醇溶蛋白/YFP融合基因的质粒图。图2显示了关于gamma-玉米醇溶蛋白/YFP融合肽纯化的Ni螯合层析。图3显示了对gamma-玉米醇溶蛋白/YFP洗脱谱(Profile)的SDS-PAGE分析。图4显示了 gamma-玉米醇溶蛋白/YFP的Maldi-TOF肽质谱。图5显示的共焦显微镜图像显示了融合肽的细胞摄取和内在化A.用Hoechst33342染色的胡萝卜单细胞，其显示细胞核；B.胡萝卜单细胞，其显示细胞核和胞质中的gamma-玉米醇溶蛋白/YFP荧光定位；C.用Hoechst33342染色的胡萝卜JTNTI细胞，其显示细胞核；D.烟草JTNTl细胞，其显示细胞核和胞质中的gamma-玉米醇溶蛋白/YFP荧光以及用Hoechst 33342的蓝色核染色；E.共焦图像，其展示靶向JTNTl细胞的质膜和细胞核两者的ga_a-玉米醇溶蛋白/YFP融合肽；及F和G，其分别显示相应的明视野图像和共焦/明视野图像的重叠。图6显示了 pDAB3831的质粒图。专利技术详述在以下的描述和表中，使用了许多术语。为了提供对说明书和权利要求书(包括此类术语给予的范围)的清楚且一致的理解，提供了以下定义回交。回交是育种人员将杂种后代往回与亲本之一，例如第一代杂种F1与F1杂种的亲本基因型之一重复杂交的方法。胚。胚可以是成熟的种子内含有的小植物。玉米醇溶蛋白。玉米醇溶蛋白指自玉米面筋粗粉(gluten meal)生成的玉米蛋白。它缺乏氨基酸赖氨酸和色氨酸，因此它不合适作为饮食蛋白的唯一来源。它在水和酒精中不可溶，但是在含水酒精、二醇和乙二醇醚中是可溶的。它发挥膜和涂层功能以为坚果和谷物产物提供水分屏障。它还发挥糖果和小块商品(panned goods)糖楽;的涂层功能。纳米微粒。一种具有至少I纳米级尺寸，通常小于IOOnm的微观颗粒。适合于用于本专利技术的纳米微粒可以具有lnm-0. 4um的大小范围。量子点可以具有Inm-IOnm,优选地2-4nm的中值直径。纳米颗粒可以选自金纳米微粒、金包被的纳米微粒、多孔性纳米颗粒、中孔性纳米颗粒、娃土纳米颗粒、聚合物纳米颗粒、鹤纳米颗粒、明胶纳米颗粒、纳米壳(nanoshell)、纳米核心(nanocore)、纳米球(nanosphere)、纳米棒(nanorod)、磁性纳米微粒及其组合。量子点。量子点是限制导带电子、价带空穴、或激子(导带电子和价带空穴的束缚对(bound pair))在所有三个空间方面的运动的半导体纳米结构。该限制可以由静电势(由外部电极、掺杂、应变杂质产生)、本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2010.03.31 US 61/319,7641.一种将感兴趣的分子导入具有细胞壁的植物细胞中的方法，该方法包括 提供具有细胞壁的植物细胞； 将gamma-玉米醇溶蛋白肽与感兴趣的分子相互作用以形成gamma-玉米醇溶蛋白连接结构； 将所述具有细胞壁的细胞和所述ga_a-玉米醇溶蛋白连接结构置于彼此接触中；并 容许将所述ga_a-玉米醇溶蛋白连接结构摄取入所述具有细胞壁的细胞中。2.依照权利要求I的方法，其中将gamma-玉米醇溶蛋白肽与感兴趣的分子相互作用包括将所述感兴趣的分子与所述gamma-玉米醇溶蛋白肽融合。3.依照权利要求I的方法，其进一步包括容许将所述gamma-玉米醇溶蛋白连接结构摄取入包含细胞壁的植物细胞的区室中。4.依照权利要求3的方法，其中所述区室选自下组胞质溶胶、细胞核、液泡形成体、质体、黄化质体、色质体、白色体、油质体、蛋白质体、造粉体、叶绿体、和双层膜的腔。5.依照权利要求I的方法，其中所述包含细胞壁的植物细胞选自下组烟草、胡萝卜、玉米、芸苔(canola)、油菜籽(rapeseed)、棉花、棕榈、花生、大豆、稻属物种(Oryza sp.)、拟南芥属物种(Arabidopsis sp.)、蓖麻属物种(Ricinus sp.)、和甘鹿细胞。6.依照权利要求I的方法，其中所述植物细胞来自选自下组的组织胚、分生组织、愈伤组织、花粉、叶、花药、根、根尖、花、种子、荚果和茎。7.依照权利要求I的方法，其中所述gamma-玉米醇溶蛋白肽包含SEQID NO I。8.依照权利要求I的方法，其中所述感兴趣的分子包括选自下组的组分核酸、DNA、RNA、RNAi分子、基因、质粒、粘粒、YAC、BAC、多肽、酶、激素、糖肽、糖、...
【专利技术属性】
技术研发人员：NC萨姆伯朱，JP萨缪尔，G林，SR韦布，FG伯劳格斯，
申请(专利权)人：陶氏益农公司，
类型：
国别省市：
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