微孔阵列芯片及其制造方法技术

本发明专利技术涉及一种微孔阵列芯片，该微孔阵列芯片在基板的一侧主表面上具有多个微孔，上述微孔具有在一个微孔中仅可容纳一个生物体细胞的形状和尺寸，在与微孔的开口相同的基板表面上具有微孔的标记。还涉及一种微孔阵列芯片，该微孔阵列芯片在基板的一侧主表面上具有多个微孔，上述微孔具有在一个微孔中仅可容纳一个生物体细胞的形状和尺寸，上述微孔的开口部具有突起部，使开口部变狭窄。又涉及上述微孔阵列芯片的制造方法，该方法具有以下步骤：在基板的至少一侧主表面上形成膜的步骤；在形成的膜上涂布抗蚀剂的步骤；经由具有微孔图案的掩模，对上述抗蚀剂面进行曝光，除去抗蚀剂的非硬化部分的步骤；蚀刻上述膜和基板的暴露部分，打微孔阵列形状的孔的步骤；以及除去抗蚀剂的步骤。还涉及一种微孔阵列芯片，该微孔阵列芯片具有多个微孔，是用于在各微孔中容纳1个被检生物体细胞的硅制微孔阵列芯片。上述微孔具有在一个微孔中仅可容纳1个生物体细胞的形状和尺寸。

【技术实现步骤摘要】
微孔阵列芯片及其制造方法本申请是申请日为2004年9月22日，申请号为200480034519.6的、专利技术名称和本专利技术相同的专利技术专利申请的分案申请。
本专利技术的第一方案涉及可用于抗原特异性淋巴细胞等生物体细胞的检测等的微孔阵列芯片。本专利技术的第一方案特别涉及可容易地进行微孔定位的微孔阵列芯片(MicrowellArrayChip)。本专利技术的第二方案涉及微孔对生物体细胞的捕集率和收集率均优异的微孔阵列芯片及其制造方法。本专利技术的第三方案涉及可用于抗原特异性淋巴细胞等生物体细胞的检测等的硅制微孔阵列芯片。本专利技术的第三方案特别涉及根据需要，可容易地将容纳在微孔中的生物体细胞进行回收的微孔阵列芯片。
技术介绍
以往，抗原特异性淋巴细胞通过例如使用96孔板，每孔加入约200,000个淋巴细胞，在抗原存在下培养3天至一周，由此进行检测(“リンパ球机能检索法”矢野纯一、藤原道夫编著，中外医学社(1994年)；“免疫实验操作法I、II”右田俊介、绀田进、本庶佑、滨冈利之编集，南江堂(1995年))。该方法中，可确认约200,000个淋巴细胞群中存在抗原特异性淋巴细胞。但是无法鉴定存在于淋巴细胞群中的各抗原特异性淋巴细胞。对于此，近年来人们开发利用了通过将用荧光染料标记的抗原分子与淋巴细胞混合，来使荧光标记抗原与抗原特异性淋巴细胞的抗原受体结合，再使用流式细胞仪检测结合有荧光标记抗原的淋巴细胞的方法(AltmanJD，MossPA，GoulderPJ，BarouchDH，McHeyzer-WilliamsMG，BellJI，McMichaelAJ，DavisMM.Phenotypicanalysisofantigen-specificTlymphocytes(抗原特异性T淋巴细胞的表型分析)，Science，274：94-96，1996)。该方法可以鉴定与抗原结合的1个淋巴细胞。还可以分选1个与抗原结合的淋巴细胞。但是，上述检测方法中，为了分选，必须有细胞分选仪这样高价且复杂的仪器，并且还有以下的问题。(1)用于分选的仪器条件设定较难，用于分选细胞的仪器操作必须熟练。(2)由于背景噪声高，抗原特异性淋巴细胞的频度为0.1％以下时，无法检测抗原特异性淋巴细胞。(3)分选细胞的效率低。(4)分选频度低的细胞需要时间。(5)可以确认有抗原结合，但难以对结合有抗原的淋巴细胞的反应进行分析。作为其它的抗原特异性淋巴细胞检测法，还开发出通过将与磁珠结合的抗原分子与淋巴细胞混合，使结合有磁珠的抗原与抗原特异性淋巴细胞的抗原受体结合，使用磁石分选抗原特异性淋巴细胞的方法(AbtsH，EmmerichM，MiltenyiS，RadbruchA，TeschH，CD20positivehumanBlymphocytesseparatedwiththemagneticsorter(MACS)canbeinducedtoproliferationandantibodysecretioninvitro.JournalofImmunologicalmethods125：19-28，1989.)。该方法无需复杂的装置，细胞分选所需的时间短，可以确认有抗原结合。但无法对结合有抗原的淋巴细胞是否与抗原反应(细胞内信号转导、RNA合成、蛋白质合成等细胞的代谢生理反应)进行分析。另外，抗原特异性淋巴细胞的频度为0.1％以下时，无法检测抗原特异性淋巴细胞。而本专利技术人对于提供无需复杂的装置、细胞分选时间短、可确认有抗原结合、也可检测频度低的抗原特异性淋巴细胞(0.001％以上)、可以对结合有抗原的淋巴细胞是否与抗原反应进行分析、并且可分选抗原特异性淋巴细胞的抗原特异性淋巴细胞检测方法进行了各种研究。对个别检测一个个淋巴细胞的抗原特异性、并且回收检测出的抗原特异性淋巴细胞的方法进行了开发。但是，目前为止尚未知有可个别检测一个个淋巴细胞的抗原特异性，并可回收所检测的抗原特异性淋巴细胞的微孔阵列芯片。因此，本专利技术人对于提供可利用于上述检测法中、可将一个淋巴细胞容纳在一个微孔中的微孔阵列芯片的情况进行了各种研究。并试作了在基板表面形成可容纳一个淋巴细胞左右大小的微孔的微孔阵列芯片，进行了将淋巴细胞容纳进(捕集到)微孔中和从微孔中回收的测试。已经清楚：在该过程中，在设置有很多微细的微孔的阵列芯片上回收检测出的抗原特异性淋巴细胞时，特别是将检测与回收以分别的步骤进行时，为了从已检测的微孔中确实无误地回收抗原特异性淋巴细胞，必须进行微孔的定位。即，如果只是将很多微孔排列的阵列芯片，是不容易进行特定的微孔定位的。还清楚了：上述过程中，将淋巴细胞容纳入微孔中时，如果使用细胞悬浮液将淋巴细胞捕集到微孔中，然后清洗阵列芯片，则大多数细胞从微孔中流出，捕集率和填充率显著降低。因此，本专利技术的第一目的在于提供：可利用上述检测法、可将一个淋巴细胞容纳入一个微孔中的微孔阵列芯片。本专利技术的第一方案的目的特别在于提供：可容易地确定多数且微细的微孔的位置的微孔阵列芯片。本专利技术的第二目的在于提供：捕集到微孔中的淋巴细胞等细胞在之后清洗时不易从微孔中流出的微孔阵列芯片。本专利技术的第三目的在于提供：可利用上述检测法、可将一个淋巴细胞容纳入一个微孔中的微孔阵列芯片。本专利技术的第三方案的目的特别在于提供：可容易地将容纳在微孔中的一个淋巴细胞回收的微孔阵列芯片。本专利技术的第三方案的目的在于进一步提供：不限于淋巴细胞，可将一个生物体细胞容纳进一个微孔中的微孔阵列芯片。
技术实现思路
用以实现上述第一目的的本专利技术的第一方案如下。(1)微孔阵列芯片，该微孔阵列芯片在基板的一侧主表面上具有多个微孔，上述微孔具有在一个微孔中仅可容纳一个生物体细胞的形状和尺寸，在与微孔的开口相同的基板表面上具有微孔的标记。(2)(1)的微孔阵列芯片，其中多个微孔以相同的间隔纵横配置，每组规定个数的微孔上设有标记。(3)(1)或(2)的微孔阵列芯片，其中多个微孔是将规定个数的微孔分成各组，设置于基板的主表面上，并设有标记以掌握各组的位置。(4)(3)的微孔阵列芯片，其中属于一个组的微孔的数量在10-10000的范围内。(5)(1)-(4)中任一项的微孔阵列芯片，其中标记含有荧光材料或反射材料。(6)(1)-(5)中任一项的微孔阵列芯片，其中标记是用于定位的标记。(7)(1)-(6)中任一项的微孔阵列芯片，其中基板是硅、金属或树脂制的。(8)(1)-(7)中任一项的微孔阵列芯片，其中上述微孔是圆筒形、由多个面构成的多面体、倒圆锥形或倒角锥形、或上述两种以上形状的组合形状。(9)(1)-(8)中任一项的微孔阵列芯片，其中与微孔的平面形状内切的最大圆的直径是要容纳到微孔中的生物体细胞直径的0.5-2倍的范围，且微孔的深度是要容纳到微孔中的生物体细胞直径的0.5-4倍的范围。(10)(1)-(9)中任一项的微孔阵列芯片，其中生物体细胞是淋巴细胞，所述微孔阵列芯片用于以一个单位检测抗原特异性淋巴细胞。(11)(1)-(10)中任一项的微孔阵列芯片，其中上述主表面上具有疏水性区域，该疏水性区域设置成包围上述多个微孔。(12)(11)的微孔阵列芯片，其中上述疏水性区域具有硅表面或含氟表面。用以实现上述第二目的的本专利技术的第二方案如下。(13)微孔阵列芯片，该本文档来自技高网...

【技术保护点】
回收单个样品生物细胞的方法，其包含：在硅制的、包含多个微孔的微孔阵列芯片的每一微孔中储存单个样品生物细胞；以及，从所述的微孔中回收所述储存的单个样品生物细胞,其中，所述微孔的形状和尺寸仅容纳一个生物细胞，且其中所述微孔的内壁涂覆防水膜以防止生物细胞粘附于所述微孔的内壁，且易于从所述微孔回收所储存生物细胞。

【技术特征摘要】
2003.09.25 JP 2003-333363;2003.09.29 JP 2003-33671.回收单个样品生物细胞的方法，其包含：在硅制的、包含多个微孔的微孔阵列芯片的每一微孔中储存单个样品生物细胞；以及，从所述的微孔中回收所述储存的单个样品生物细胞，其中，每一微孔的形状和尺寸仅容纳一个生物细胞，其中，在实施平滑化处理后，在所述微孔的内壁形成氟碳膜，其中，所述微孔的内壁表面形状是平滑的意味着，所述表面的凹凸高度是0-0.1微米的范围，其中所述微孔的内壁涂覆氟碳膜以防止生物细胞粘附于所述微孔的内壁，且易于从所述微孔回收所储存生物细胞，其中，所述微孔阵列芯片的孔以外的表面涂覆氧化硅膜，且其中，所述单个样品生物细胞是与特异抗原反应的抗原特异性B淋巴细胞。2.权...

【专利技术属性】
技术研发人员：村口笃，岸裕幸，时光善温，近藤佐千子，小幡勤，藤城敏史，横山义之，锅泽浩文，高林外广，谷野克巳，
申请(专利权)人：富山县政府，维涡里斯公司，
类型：发明
国别省市：