本发明专利技术涉及一种制备肠道病毒病毒样颗粒的方法，以及一种可展示外源抗原的重组肠道病毒病毒样颗粒的制备方法。本发明专利技术优点在于：本发明专利技术提供了一种新型的酵母来源的小RNA病毒科肠道病毒属病毒样颗粒的制备方法及其免疫原性检测的方法，以及以肠道病毒病毒样颗粒作为一种全新的多价免疫原展示平台的应用方法，免疫试验证明本发明专利技术制备的肠道病毒病毒样颗粒可产生保护性中和抗体。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物
，具体地说，是酵母来源的小RNA病毒科肠道病毒属病毒样颗粒的生产、纯化、免疫原性检测及其应用等相关技术。
技术介绍
病毒样颗粒与多价免疫原展示平台 病毒样颗粒(virus-like particles, VLPs)是由病毒的结构蛋白自发包装形成的空 心颗粒，不含病毒核酸，不能自主复制，无感染性，在形态和结构上与真正病毒颗粒相同或相似，免疫原性与病毒颗粒效价相当。与病毒的这种相似性使得病毒样颗粒成为了一种新兴的安全的结构病毒学和疫苗学研究载体。另外，作为新型异源免疫原展示载体，重组病毒样颗粒免疫原展示平台的研究近年来发展迅速。所谓重组病毒样颗粒免疫原展示平台，即通过基因重组技术，在病毒样颗粒暴露于表面的肽段中插入或置换异源的免疫原，使该免疫原展现在颗粒的最外层空间，以达到展示异源免疫原的目的。病毒样颗粒及重组病毒样颗粒免疫原展示平台的研究主要依赖于基因工程、发酵工程等技术手段及结构学和免疫学等领域的研究方法。目前从原核表达系统到哺乳动物表达系统都有病毒样颗粒成功表达的案例，较为成熟的且有代表性的重组病毒样颗粒免疫原展示平台有噬菌体衣壳蛋白颗粒、乙型肝炎核心蛋白颗粒(HBcAg)和兽棚病毒(flock house virus, FHV)病毒样颗粒。根据结构病毒学分析，肠道病毒病毒样颗粒具有潜在的外源免疫原插入或置换位点。小RNA病毒科肠道病毒概览 小RNA病毒科的成员都具有长度从6000-9000bp不等的单链RNA基因组，其无包膜的正二十面体病毒颗粒直径在22-30nm之间，通常通过粪口途径传播，其家族病毒成员庞杂，且感染哺乳动物群类广泛，最新的病毒分类学定义该科共分为五个属，即鼻病毒属、口蹄疫病毒属、肠道病毒属、心病毒属和甲肝病毒属。肠道病毒属主要包括脊髓灰质炎病毒、人肠道病毒68-71型、埃柯病毒和柯萨奇病毒等感染人类的几类病毒。著名的脊髓灰质炎病毒可引发小儿麻痹症，人肠道病毒70型可引起急性结膜炎，而人肠道病毒71型、柯萨奇病毒和埃柯病毒可引起成人腹泻及婴幼儿手足口病或心肌炎。目前除脊髓灰质炎病毒外，其他病毒均无投产疫苗。当今在发展中国家通用的脊髓灰质炎萨宾口服疫苗是病毒减活疫苗，存在一定致病风险，WHO分析报告指出，目前脊髓灰质炎II型病毒已经从自然界消失，而萨宾疫苗包含脊髓灰质炎全部三型的病毒，所以目前感染脊髓灰质炎II型病毒的病例全部是由于使用疫苗后减活病毒活性增强而引发的。萨宾疫苗的另一大潜在风险不易觉察，但可能影响将是长期的和不可控的，由于使用的是减活病毒，病毒可以随粪便排出，可能与自然界野生的各类肠道病毒发生基因交换，产生新型肠道病毒。手足口病的致病病毒及其疫苗研究现状 手足口病(hand-foot-and-mouth disease, HFMD)是近年来引起全球高度重视的一种急性病毒性传染病，主要易感人群为五岁以下婴幼儿。患儿手、足、口腔等表皮部位可产生分散性疱疹，对少数患儿可引起心肌炎、肺水肿、无菌性脑膜脑炎等并发症，重症患儿甚至可能死亡。自2007年来，这种疾病在我国华北、华中等地区持续性流行，且每年的病例数有递增趋势，严重危害我国儿童身体健康。人肠道病毒71型病毒和柯萨奇A16型病毒是在我国流行的手足口病主要的致病病毒。人肠道病毒71型病毒(Enterovirus 71, EV71)隶属小RNA病毒科OcYcoraaririaofe),肠道病毒属A类,是一种通过粪口及粘膜途径传播的病毒。该病毒由一条基因组单链RNA和正二十面体的衣壳构成，不含包膜，其中衣壳由VP1、VP2、VP3、VP4四种结构蛋白构成。在EV71病毒的生活周期中，病毒衣壳的包装是一个自发的并且具有多级步骤的过程。首先，病毒基因组RNA翻译出一个包括病毒所有结构蛋白和非结构蛋白的长的肽链(polyprotein)，在病毒蛋白酶剪切作用下，产生出结构蛋白前体Pl和病毒蛋白酶3⑶；P1通过3⑶的剪切作用生成结构蛋白VP1、VP3和结构蛋白VP2、VP4的前体蛋白VPO ；VP0、VP1和VP3可以自组装形成完整的正二十面体的不含基因组核酸的空衣壳颗粒(emptycapsid);若形成的空衣壳包裹了基因组RNAJU VPO剪切为VP2、VP4蛋白，并形成成熟的含 有病毒基因组的病毒颗粒。柯萨奇A16型病毒(Coxsackievirus A16, CVA16)与EV71病毒在生活周期、病毒蛋白的结构和功能等方面有极高的相似度。病毒和免疫学界已经针对手足口病疫苗制备进行了一系列的基础研究，提出并尝试了多种形式的备选疫苗，包括病毒减活疫苗、灭活疫苗、DNA疫苗、合成肽疫苗、亚单位疫苗，这些疫苗形式各具特色但也存在局限。其中以减活疫苗的免疫原性和保护性最高，且成本低，但由于其制备过程是模仿脊髓灰质炎病毒萨宾疫苗，所以存在一定的致病风险。DNA疫苗可以产生体液免疫和细胞免疫反应，但DNA疫苗这种疫苗形式本身的安全性争议一直是制约其发展最重要的因素。EV71病毒的两段合成肽，即SP55 (VPl 163_177aa)和SP70(VPI 208-222aa)，可诱导小鼠产生针对EV71病毒的中和性抗体，但由于效价问题尚未应用于疫苗开发。亚单位疫苗包括结构蛋白单体(如VPl)和病毒样颗粒两种形式，结构蛋白单体由于其较低的免疫原性而保护性较差，而病毒样颗粒很好的模拟了完整的病毒结构因而具有与减活病毒疫苗相当的免疫原性和保护性。平衡疫苗安全性和保护性这两项要素，病毒样颗粒是理想的备选疫苗。EV71病毒样颗粒的研究已经有近十年的历史，根据文献报道，使用昆虫杆状病毒表达系统可以成功制备出EV71病毒样颗粒，其原理是，通过杆状病毒载体在体外培养的昆虫细胞中共表达人肠道病毒71型病毒蛋白Pl和3CD，利用蛋白酶3CD特异性剪切Pl蛋白为VPO、VPU VP3三种蛋白，这三种蛋白在昆虫细胞中自组装成为病毒样颗粒。CVA16病毒也可以使用相同的方法制备病毒样颗粒。昆虫杆状病毒制备的病毒样颗粒的免疫原性已经得到证明。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有技术中的不足，提供一种制备肠道病毒病毒样颗粒的方法。为实现上述目的，本专利技术采取的技术方案是一种制备肠道病毒病毒样颗粒的方法，包括以下步骤(a)优化Pl基因，构建表达Pl蛋白的pYES2载体重组子； (b)构建具有色氨酸缺陷互补基因且敲除Ura缺陷互补基因的改造载体pYES2-Trp，优化3⑶基因，构建表达3⑶蛋白的pYES2-Trp载体重组子； (c)将步骤(a)和步骤(b)中构建的载体重组子共同转化进入酿酒酵母表达菌株，酵母培养发酵； (d)将步骤(C)中培养的酵母进行破碎、纯化和鉴定，即得肠道病毒病毒样颗粒，所述的肠道病毒病毒样颗粒由VPO、VP1、VP3三种蛋白单体组成。优选的，所述的步骤(C)中酵母发酵诱导培养基为YPG培养基，诱导表达的菌液初始浓度为10D，收菌浓度为50D。另一优选的实施例中，所述的肠道病毒为EV71病毒，包括以下步骤 (a)构建表达EV71-P1蛋白的pYES2载体重组子使用引物SEQID NO. 3、引物SEQ IDNO. 4，以基因合成产物SEQ ID NO. 11作为模板，通过PCR的方法扩增得到密码子优化后的EV71本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种制备肠道病毒病毒样颗粒的方法，其特征在于，包括以下步骤：（a）优化P1基因，构建表达P1蛋白的pYES2载体重组子；？（b）构建具有色氨酸缺陷互补基因且敲除Ura缺陷互补基因的改造载体pYES2？Trp，优化3CD基因，构建表达3CD蛋白的pYES2？Trp载体重组子；（c）将步骤（a）和步骤（b）中构建的载体重组子共同转化进入酿酒酵母表达菌株，酵母培养发酵；（d）将步骤（c）中培养的酵母进行破碎、纯化和鉴定，即得肠道病毒病毒样颗粒，所述的肠道病毒病毒样颗粒由VP0、VP1、VP3三种蛋白单体组成。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：陈荣，李浩洋，吕柯，何娅玲，
申请(专利权)人：中国科学院上海巴斯德研究所，
类型：发明
国别省市：
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