一种大白菜eIF(iso)4E.c位点碱基缺失突变的特异性分子标记及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种与大白菜eIF(iso)4E.c野生型和碱基缺失突变体鉴定直接相关的位点特异性共显性ASM标记：与野生型位点检测相关的标记命名为ASM-W，片段大小128bp，如SEQ?ID?No.1所示；对应的碱基缺失突变位点检测相关的标记命名为ASM-m，片段大小124bp，SEQ?ID?No.2所示。本发明专利技术利用同源克隆技术发现了eIF(iso)4E.c位点的一个突变体并开发了鉴定该位点的分子标记。利用该标记可以对回交转育后代的基因型进行准确选择。同时该标记还可用于对大白菜种质资源进行筛查，以寻找遗传背景更加丰富的突变体材料。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种基因的突变体及其相关位点特异性分子标记的开发，尤其涉及一种大白菜真核生物翻译起始因子eIF(iS0)4E. c的碱基缺失突变及其位点特异性分子标记开发和应用。突变体能够为选育含该突变位点的抗病毒大白菜种质提供变异源，位点特异分子标记能够直接应用于分子标记辅助育种来选择含有该突变位点的大白菜材料，提高 eIF4E突变体的选择效率，属于生物

技术介绍
大白菜(Brassica rapa L. ssp pekinensis)是十字花科重要的蔬菜作物,原产于中国，目前在世界各地均有种植。尤其在我国蔬菜的常年供应和淡季蔬菜调剂中已经成为蔬菜产品供给的重要组成部分，因而对人们生活具有重要影响。在大白菜生产过程中，常遭病毒病、霜霉病和软腐病等病害的威胁。就整体而言病毒病的危害最为严重，且没有普遍适用的抗病毒病药剂或其它行之有效的控制技术。培育抗病毒大白菜新品种是应对病毒病危害的首选途径。苗立强等研究发现，我国大白菜病毒病的病原分离物中70%是芜菁花叶病毒(Turnip Mosaic Virus，TuMV)、还有少量黄瓜花叶病毒(Cucumber Mosaic Virus, CMV)和其它病毒。因此我国大白菜抗病毒病育种的主攻目标是抗TuMV。培育抗TuMV大白菜新品种的两个关键要素是拥有丰富的抗TuMV种质资源和高效的育种效率。我国是大白菜原产地，种质资源非常丰富，其中不乏抗TuMV的优良资源，同时也有更多品质优良但不抗病毒的资源。在常规育种实践中，常通过回交转育的手段获得更多遗传背景丰富的抗性材料。随着分子标记技术的兴起及研究的深入，标记辅助选择在常规育种操作中已经成为提高选择效率、缩短育种年限的主要手段。一些跨国的育种集团更是不惜重金把创新资源和开发与重要农艺性状紧密连锁的分子标记作为育种攻关的主要内容。一般而言，要寻找与某农艺性状紧密连锁的分子标记，往往需要先选择在目标性状方面存在显著差异的亲本，并构建分离群体$2，1 1，8(1，0!1等)，采用混合分群(BSA) 和传统的分子标记(如RAPD，SRAP, AFLP, SSR等)技术进行分析，用相应的软件分析所得标记与性状的连锁距离，最终得到与目标性状连锁的分子标记。目前报道的与大白菜抗芜菁花叶病毒(TuMV)位点连锁的分子标记正是采用上述方法得到的。由于不同研究者所用材料和所选择的标记类型不同，所得到的与抗病毒特性连锁的标记距离亦不同，介于 3. 8-15. 36cM。由于这些标记与性状的连锁程度不够紧密，因而其用于大白菜抗TuMV辅助育种尚有一定的距离。另一方面，由于拟南芥与大白菜同属十字花科，其抗病毒相关功能基因已有较深入的研究；同时大白菜的全基因组序列已经公布。所以可以将拟南芥功能基因研究的结果和大白菜基因组序列信息结合，直接从抗病毒相关功能基因的角度入手，通过对大白菜自然群体在某一个重要功能基因位点的自然变异入手，寻找抗病毒相关功能基因的突变体；针对突变位点开发位点特异性分子标记(Allele specific marker, ASM)，则这种标记本身与性状直接相关，这无疑会使标记辅助选择更加精准。在抗病毒功能基因研究方面近年来发现，由隐性单基因控制的抗病毒性状多与真核生物翻译起始因子4E及其异构体的突变有关。Wittmann等和 L6onard 等分别证明拟南芥 eIF4E 和 eIF (iso) 4E 可以同TuMV的病毒基因组结合蛋白(VPg)相互作用。这种相互作用的关键氨基酸与真核生物自身mRNA翻译所需的关键氨基酸位点不同，所以eIF4E及eIF(is0)4E的一些氨基酸突变不影响植物自身的生长发育、却导致病毒与寄主不能发生互作，从而使寄主表现出抵抗病毒侵染的特性。Ryder 在生菜、Ruffel 在辣椒、 Nieto 在舌甘瓜等重要蔬菜作用中已经发现了不少这样的突变体资源，Yeam 等在辣椒中针对突变位点开发了相应的位点特异性CAPs标记并用于抗病毒材料转育时的辅助选择。从其他作物的eIF4E和eIF (iso) 4E突变及其在抗病毒中的作用推测，大白菜自然群体中也可能存在eIF4E和eIF(is0)4E的突变体，且这种突变可能与大白菜的抗病毒特性有关。我国大白菜种质资源十分丰富，但目前，国内外有关大白菜抗病毒特性与 eIF4E和eIF(iso)4E关系的研究很少，涉及的材料极为有限。Rusholme等以高抗TuMV的大白菜自交系RLR22和病毒敏感材料 R-0-18为亲本，构建BClFl群体，进行抗TuMV(⑶NI和CZEl株系)遗传研究。结果发现了一个大白菜抗病毒隐性遗传位点retrOl和一个显性位点ConTROl, RFLP标记关联分析分别发现了与retrOl连锁的标记pN202el和与ConTROl连锁的标记p085el。进一步采用southern 杂交的手段发现，在A基因组中分别有3个拷贝的eIF4E (分别位于染色体NI、N3和NS)和 3个拷贝的eIF(is0)4E (分别位于染色体N4、N5和NS)。作者根据杂交结果，推测位于第8 染色体上的eIF4E和eIF (iso) 4E可能与ConTROI有关，而位于第4染色体上的eIF (iso) 4E 可能与retrOl有关。文中没有关于两个基因的序列信息报道。Jenner等从病毒敏感材料 R-0-18 中克隆得到了 eIF4E 和 eIF(iso)4E 各三个拷贝，分别命名为 BraA. eIF(iso)4E. C、BraA. eIF4E. b、 BraA. eIF4E. c 和 BraA. eIF(iso)4Ε· a>BraA. eIF(iso)4E. b、BraA. eIF(iso)4E. c。除 BraA. eIF4E. b和BraA. eIF(iso)4E. b以外，其余4个基因分别转化拟南芥At. eIF(iso)4E功能缺失突变体, 然后对所有转基因株系接种TuMV加拿大株系CDNl，进行病毒敏感性互补实验。根据病情指数及ELISA结果，发现所转的四个基因均能使突变体完全或部分恢复对TuMV侵染的敏感性。这表明，在TuMV侵染白菜类蔬菜作物时，eIF4E和eIF (iso) 4E都可能参与病毒与寄主的相互作用。同时作者指出，要想在大白菜中获得与eIF4E和eIF(iso)4E有关的抗病毒材料，则这几个基因需同时丧失功能。截止目前，大白菜在上述两个基因位点的突变及相关突变体检测的标记开发国内外未见报道。鉴于此，有必要对我国丰富的大白菜抗/感TuMV材料中eIF4E和eIF (iso) 4E各个位点的多态性进行广泛筛查，以发现各位点可能存在的突变类型；同时针对突变位点与野生型的序列差异，开发与突变体检测有关的位点特异性分子标记。有以下几个方面的潜在益处①可以将该标记用于筛查大白菜种群，提供高效的大白菜突变体检测手段；②当其他位点发现突变类型时，可以采用同样的方法开发标记；③当多个位点的突变位于不同的材料中时，可以通过标记辅助选择手段将多位点的突变聚合在一起，创造广谱抗TuMV大白菜新种质；④在培育广谱抗TuMV大白菜新品种时，可以实现标记辅助选择，提高育种效率。 由于这种标记直接位于功能基因内部，因此选择的准确率达1本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种大白菜eIF(iso)4E.c位点碱基缺失突变的特异性分子标记，其特征在于：与野生型位点检测相关的标记命名为ASM？W，片段大小128bp，如SEQ？ID？No.1所示；对应的碱基缺失突变位点检测相关的标记命名为ASM？m，片段大小124bp，如SEQ？ID？No.2所示。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：刘栓桃，赵智中，卢金东，张志刚，李巧云，
申请(专利权)人：山东省农业科学院蔬菜研究所，
类型：发明
国别省市：