本发明专利技术提供了一种尖吻蝮蛇血凝酶-B，其是从尖吻蝮蛇蛇毒中分离到的一种高活性血凝酶，该酶为由236个氨基酸组成的单链糖蛋白，具有SEQ?ID?No.1所示的氨基酸序列。链内含有6对二硫键；SDS-PAGE分子量约35kD，脱糖基化后的酶分子量26116.7Da；等电点pI?6.0。酶分子在Asn77,100,229位点上具有杂合多聚糖修饰。该酶为丝氨酸蛋白酶。本发明专利技术还提供了该酶的分离纯化方法，包括通过预处理去除不溶物，再通过两次阴离子交换柱层析和一次Sephdex-G75分子筛层析，收集活性洗脱峰，经透析、冻干，即得高纯度蛇毒血凝酶。其比活力不低于2000U/mg，HPLC分析纯度可达95%以上，以蛇毒原料重量计收得率为0.25%－0.30%。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种丝氨酸蛋白酶，具体地说是一种尖吻蝮蛇蛇毒血凝酶-B，本专利技术还涉及其分离纯化方法。
技术介绍
蝮亚科(Crotalinae)蛇毒中存在一类与血液凝固相关的蛋白酶，通常称之为“类凝血酶”(thrombin-like enzyme,简称TLC)。类凝血酶与凝血酶(thrombin)的表观作用相似，均可以使血浆中纤维蛋白原转化为纤维蛋白而“凝固”。然而，两种酶作用机理不同，类凝血酶不激活凝血系统中X III因子，其与纤维蛋白原作用仅产生非交联纤维蛋白，不会导致血栓形成，其形成的凝血块可被5M尿素溶解；而凝血酶能够激活凝血系统中X III 因子，其与纤维蛋白原作用形成交联纤维蛋白，可导致血栓形成，其形成的凝血块不能被5M尿素溶解。近50年来的科学研究发现在40多种蛇毒中含有类凝血酶成分，有30余种得到分离纯化，其中有10余种类凝血酶的全部或部分氨基酸序列得到阐明。已发现的TLC分子量多在29 45kD之间，大多数为酸性糖蛋白。在以往已经发现的蛇毒TLC中，蛋白质一级结构多为单链。其商品化典型代表产品“立 Ε雪”(Reptilase)系由瑞士 Solco Basle公司生产，是由巴西矛头蝮蛇(Bothrops.atiOx)蛇毒中分离出的一种凝血酶，该酶前体由255个氨基酸构成，N端有24个氨基酸形成的引导肽，活性酶含231氨基酸，SDS-PAGE分子量34kD。含6个链内二硫键(位点7_139，26-42,74-230,1 18-184，150-163，174-199)，为单链糖蛋白(糖基化位点为 Asn146’ 225)，脱去糖基后的分子量为255 17Da。另一个已经商品化的产品是意大利RAVIZZ公司生产的“Botropase”,该凝血酶是从美洲矛头蝮蛇(Bothrops. jararaca)蛇毒中分离得到的。活性酶含231氨基酸，在氨基酸序列上与Iteptilase比较在14个位点上有差别。此外，国内学者沈居仁等2006年从中国尖吻蝮蛇(Agkistrodon acutus)蛇毒中分离得到一种高活性血凝酶，该酶为单链，SDS-PAGE分子量36±2kD，等电点为6. 59，比活为2000U-3000U/mg，N-末端15个氨基酸序列为VIGGNECDTNEEHFL。以蛇毒原料重量计收得率为O. 03%。到目前为止，商品化的蛇毒血凝酶种类较少，因此寻找适合产业化的高活性高收率的蛇毒血凝酶新品种尤显必要。本专利技术人从我国广西尖吻蝮蛇(Agkistrodon acutus,俗称五步蛇)的蛇毒中分离纯化得到一种高活性血凝酶-B。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种蛇毒血凝酶-B，其是从尖吻蝮蛇蛇毒中分离得到的一种类凝血酶(TLC)。本专利技术的另一个目的在于提供了一种分离纯化上述血凝酶-B的方法。本专利技术血凝酶-B是从中国尖吻蝮蛇(Agkistrodon acutus)蛇毒中分离得到的高活性血凝酶(命名为“血凝酶-B”)，其具有SEQ ID No. I所示的氨基酸序列。该酶具有如下特征①由236个氨基酸构成的单链，SDS-PAGE分子量约为35kD，等电点pi为6. 0，②含6个链内二硫键(位点7-141，28-44，78-234，120-188，152-167，178-203)。③在 Asn77’100’229位点上具有由5种不同单糖构成的杂合多聚糖修饰。④酶活性可被苯甲基磺酰氟(PMSF)完全抑制，表明其是一种丝氨酸蛋白酶。⑤具有较好的热稳定性，40°C恒温60天酶活性可保持 90%ο应当理解，本领域技术人员可根据本专利技术公开的 氨基酸序列，在不影响其活性的前提下，取代、缺失和/或增加一个或几个氨基酸，得到所述蛋白的突变序列。因此，本专利技术蛋白还包括SEQ ID No. I所示氨基酸序列经取代、替换和/或增加一个或几个氨基酸，具有同等活性的由所述蛋白衍生得到的蛋白质。本领域技术人员可以根据本专利技术血凝酶-B的N端氨基酸序列，设计合成寡核苷酸探针，从尖吻蝮蛇毒腺组织提取mRNA，反转录并构建cDNA文库，通过上述探针筛选cDNA文库，并对筛选出的阳性克隆子分别进行测序克隆分析，从而得到编码本专利技术蛋白的基因。也可以根据本专利技术血凝酶-B的氨基酸序列直接设计合成编码本专利技术蛋白的基因。本专利技术还提供上述血凝酶-B的纯化方法，其包括如下步骤I)、蛇毒预处理；2)、将预处理后的蛇毒溶液上经预平衡的DEAE — Sephrose FF阴离子交换层析柱，用 O. OlM pH7. O 7. 5 的 PBS 洗柱，再用含 O. 02 和 O. 06M NaCl 的 O. OlM pH7. O 7. 5的PBS分段洗脱，收集O. 06MNaCl溶液的洗脱液；3)、将上述洗脱液超滤浓缩至小体积后经透析去除NaCl ；4)、将透析后的溶液再次上样至经过预平衡的DEAE — S^hrose FF层析柱，用O. OlM ρΗ7· O 7. 5 的 PBS 洗柱，再用含 O. 02,0. 04,0. 06Μ NaCl 的 O. OlM ρΗ7· O 7. 5 的PBS分段洗脱，收集O. 06Μ NaCl溶液洗脱液中的第三个洗脱峰；5)、将上述收集液超滤浓缩至小体积后经80%硫酸铵沉淀，12000g离心30分钟分离沉淀。6)、用PBS适量溶解沉淀,经Sephadex_G75进一步纯化,再经透析除盐后直接冷冻干燥。其中，步骤I)蛇毒预处理的方法是将蛇毒用适量预冷的O. 01MpH7. O 7. 5PBS溶解，离心取上清液进行透析(透析袋截留分子量为7，000D 10，000D)。通过预处理可以去除不溶的杂质以及小分子多肽，并降低溶液离子强度。具体地说可通过如下步骤进行蛇毒的预处理称取蛇毒若干克，用蛇毒重量5 10倍体积预冷的O. OlM pH7. O 7. 5的PBS于4 8 V的层析柜中搅拌溶解3(Γ60分钟，于O0C >5, 000^10, OOOg离心1(Γ20分钟，将离心上清液倾入透析袋中，离心沉淀再次加入蛇毒重量5 10倍体积预冷的PBS搅拌悬浮，再次离心。合并两次离心上清液于透析袋中，于4 8C对O. OlM ρΗ7· O 7. 5的PBS透析12 24小时，期间换液2 4次，以去除小分子多肽和降低溶液离子强度。其中，步骤2)和步骤4)采用O. OlM ρΗ7· O 7. 5的PBS预平衡DEAE — SephroseFF层析柱，然后再上样。其中，步骤3)透析的目的是去除溶液中存在的NaCl。步骤3)和步骤5)中大体积洗脱液浓缩方式为超滤浓缩(膜截留值5000-10000Da)。其中，步骤6)中采用S印hadeX_G75分子筛的目的是进一步将两次阴离子柱层析收集物中的蛋白质按分子量大小进行分离纯化。具体地将沉淀用PBS溶解后上柱，用O. OlMpH7. 4PBS洗脱液洗脱，收集洗脱液第一个峰。经本专利技术方法纯化的血凝酶-B比活力不低于2000U/mg，还原和非还原SDS-PAGE均为一条带；HPLC分析纯度95%以上。该酶具有较好的热稳定性，40°C恒温60天酶活性可保持90%。以蛇毒冻干粉原料重量计，本法纯化收得率为O. 25% - O. 3%。本专利技术血凝酶-B具有良好的凝血活性，可作为制成各种止血药物的本文档来自技高网...
【技术保护点】
尖吻蝮蛇血凝酶？B，其具有SEQ？ID？No.1所示的氨基酸序列或该序列经替换、缺失和/或添加一个或几个氨基酸得到的具有同等功能的氨基酸序列。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：孙狄，王锡娟，
申请(专利权)人：北京康辰药业有限公司，
类型：发明
国别省市：
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