抗t-PSA单克隆抗体产生的杂交瘤及检测t-PSA试剂盒的制备，属于免疫分析医学领域。本发明专利技术提供了一种特异性识别t-PSA的单克隆抗体，产生该单克隆抗体的杂交瘤，以及使用该单克隆抗体检测t-PSA的高灵敏度的方法；还提供了前列腺特异性抗原t-PSA化学发光免疫分析检测试剂盒及其制备方法，该试剂盒包括：t-PSA检测反应板、酶结合物、发光底物、标准品、质控品、浓缩洗涤液。本发明专利技术用细胞融合和杂交瘤技术研发出灵敏度高、特异性好的抗体；同时用自主研发抗体将免疫学与化学发光技术相结合，研制出检测范围宽、灵敏度高、操作方便、生产成本低的试剂盒。临床检测人血清中t-PSA的含量，用于前列腺癌早期筛查、制定治疗方案和评估预后提供重要参考依据。
【技术实现步骤摘要】
抗t-PSA单克隆抗体产生的杂交瘤及检测t-PSA试剂盒的制备
本专利技术涉及总前列腺特异性抗原(t-PSA)单克隆抗体产生的杂交瘤及检测血清中t-PSA含量的试剂盒，可广泛应用在医学和及生物化学
背景知识总前列腺特异抗原(Prostate specific antigen, t-PSA)是与前列腺癌相关的一种抗原，是一种由前列腺上皮细胞合成和分泌的单链糖蛋白，分子量34KD，由237个氨基酸残基组成，具有丝氨酸蛋白酶活性，是诊断前列腺癌较好的肿瘤标记物，其特异性达到85%-90%。前列腺癌是50岁以上的男性常见的癌症，发展缓慢，随年龄而增长，在我国，随着居民生活的日益改善、环境污染的严重以及饮食结构的改变，其发病率逐渐上升；在美国，已经将t-PSA的检测作为男性的普查指标。t-PSA的检测有利于前列腺癌的早期发现、 监视病情的进展、治疗效果检测，同时t-PSA在原发性前列腺癌和继发性前列腺癌的鉴别诊断中起着重要的作用。前列腺特异抗原是前列腺疾病价值很高的肿瘤标志，在临床上被广泛应用，t-PSA主要用在前列腺癌的诊断及分期，还可以追踪治疗效果。前列腺特异抗原并不是前列腺癌所特有的，许多前列腺肥大症或前列腺发炎也会使t-PSA上升，因此，判断是否患有前列腺癌十分的重要，需要做进一步的检查，比如做前列腺切片，以证实患有前列腺癌。目前还没有发现前列腺癌晚期的治疗方法，减少前列腺癌的死亡率，唯有依赖早期的诊断发现并给与适当治疗，从而减少前列腺癌的死亡率。目的在临床实验室检测PSA的方法主要是放射免疫分析(RIA)、免疫比浊法和酶联免疫吸附分析(ELISA)，其中RIA必须用放射性元素标记，检测设备复杂昂贵，其放射性元素的半衰期短，不能长期保存，检测结果不稳定，同时存在放射性污染也给实验操作人员带来了伤害；酶免疫分析法灵敏度低，影响因素较多，易造成假阴性和假阳性。本专利技术采用的化学发光免疫分析方法(CLIA)灵敏度比较高，可以达到10-18mol/L，快速，发光信号在几秒钟就能产生，操作方便，且不使用有害的试剂，与国内的同类试剂相比，具有灵敏度很高，操作简便，更重要的是其需要的血清量少、检测范围广、发光液持续时间长的优点，更能满足临床的需要，本专利技术的试剂与国外同类试剂相比，达到国外同类产品水平。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种抗前列腺特异性抗原单克隆抗体以及建立一种简单且具高灵敏度的检测t-PSA的方法，并将该方法应用于前列腺癌的检测。以解决现有的单克隆抗体检测t-PSA的灵敏度不够或价格昂贵，不适合临床大规模的应用的缺点。本专利技术的另一目的在于提供一种前列腺特异性抗原化学发光免疫分析测定试剂盒以及该试剂盒的制备方法。利用该试剂盒分析检测灵敏度高、特异性强。本专利技术获得了能够产生特异性识别t-PSA的单克隆抗体(mAb)的杂交瘤细胞株3-20-1与杂交瘤细胞株3-26-1，该细胞株已于2012年3月6日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址是，中国.武汉.武汉大学，保藏编号为CCTCC C201202与CCTCCC201208。此外，经过鉴定，两株单克隆抗体分别识别t-PSA的两个不同表位，通过3-20-1与3-26-1的结合建立了双抗体夹心酶联免疫反应方法，其是一种高灵敏度及高通量的检测系统。因此，本专利技术提供了下面所述的⑴至⑶的内容I.抗前列腺特异性抗原的杂交瘤细胞株，其保藏号分别为CCTCC C201202和CCTCCC201208。2.抗前列腺特异性抗原的单克隆抗体，分别由保藏号CCTCC C201202和CCTCCC201208杂交瘤细胞系所分泌，所述单克隆抗体命名为3_20_1和3_26_1。3.如权利要求I所述的杂交瘤细胞株的制备方法，其特征在于将Balb/c小鼠免疫3次后,在细胞融合前3天作最后一次加强免疫,采用ELISA法分2步进行筛选融合细胞第一步采用间接ELISA法筛选出抗前列腺特异性抗原PSA的阳性孔；第二步采用间接竞争ELISA法对第一步筛选出的阳性孔培养液进行检测，选择吸光度和灵敏度较高的阳性孔，采用有限稀释法进行克隆，克隆后10天左右采用同样的两步筛选法进行检测，如此重复3次后，最后筛选出2株杂交瘤细胞系。4.如权利要求2所述的抗前列腺特异性抗原单克隆抗体的应用，即利用所述的单克隆抗体的双抗体夹心法ELISA检测t-PSA，夹心法两两配对的抗体来源于细胞株3-20-1和3-26-1，其步骤包括(I)以所述的两两配对的单克隆抗体之一包被；·(2)加入待测样品孵育；(3)以所述的两两配对的HRP标记的另一株单克隆抗体作为二抗，加入反应体系；(4)洗涤后加入酶反应底物，以450nm读取OD值；(5)结果表明检测的灵敏度很高。5. 一种检测血清中t-PSA含量的试剂盒，包括包被有抗前列腺特异性抗原抗体的不透明聚苯乙烯板；前列腺特异性抗原系列标准品；酶标记的前列腺特异性抗原另一株单克隆抗体；上述酶所作用的化学发光底物A液和B液以及洗涤液。6，如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于不透明聚苯乙烯板采用直接物理吸附法包被单克隆抗体，包被液是磷酸盐缓冲液中；另一株前列腺特异性抗原单克隆抗体和辣根过氧化酶偶联形成酶标记抗体，采用的是改良的过碘酸钠法进行标记；前列腺特异性抗原系列标准品以小牛血清为基质，加入前列腺特异性抗原纯品配置而成；发光底物A、B为HRP-Luminol发光体系。7.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于标记抗体所用的标记酶是辣根过氧化酶，用的是高碘酸钠氧化法，所得酶标记抗体最佳的工作浓度是I : 2000;包被有抗前列腺抗原抗体的不透明聚苯乙烯板采用的是直接物理吸附法包被；发光液A液用硼砂7. 99g，硼酸3. 46g，鲁米诺O. 28g，对碘苯酚O. 07g，加工艺用水定容至700mL，避光保存；发光底物B液由下列成分组成硼砂7. 99g,硼酸3. 46g,过氧化脲O. 07g加工艺用水定容至700mL。8.如权利要求5-7所述试剂盒的制备方法，包括以下步骤(I)标准品的配制和浓度的校正将总前列腺特异性抗原t-PSA纯品，加入标准品稀释液，配制一高浓度标准品浓液，采用逐低稀释的方法稀释到各浓度，配制成0、2. 5、5、15、45、100ng/mL的系列标准品，标准品用国家标准校正。(2)包被采用O. 5mol/L，pH值为9. 5的碳酸盐缓冲液与适当浓度的前列腺特异性抗原单抗混合成抗体浓度是I μ g/mL包被液，以100 μ L/孔包被在不透明的聚苯乙烯板上，4°C孵育过夜；(3)洗板用PBS-T洗液洗板孔2次；(4)封闭 封闭液包含NaCl 8g, KCl O. 2g, Na2HP04. 12H20 2. 9g, KH2P04 0. 2g,蔗糖20. 00g,proclin300 I. 00ml,BSA 20. 00g，封闭液的 PH值为 7. 3-7. 5，150 μ L/孔封闭，湿盒孵育2h ；(5)干燥去除封闭液，过夜干燥。(6)组装为成品将聚苯乙烯板子放入铝箔袋中并放入干燥剂，密封保存。上述的抗前列腺特异性抗原的单克隆抗体，是由下列的方法所制备，步骤包括(I)用蛋白量为50ug的前列腺特异性抗原与弗氏完全佐剂混合；经15天后进行第二次相同本文档来自技高网...
【技术保护点】
抗前列腺特异性抗原的杂交瘤细胞株，其保藏号分别为CCTCC？C201202和CCTCCC201208。
【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：蓝兴国，李玉花，魏德强，赵洪梅，曹领改，
申请(专利权)人：大庆麦伯康生物技术有限公司，东北林业大学大庆生物技术研究院，李玉花，
类型：发明
国别省市：
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