本发明专利技术属于生物技术领域，公开了一种AFB1降解菌及降解酶。该降解菌为米曲霉（Aspergillusoryzane）AOYIN2012Y8CGMCCNo.5817。将米曲霉（Aspergillusoryzane）AOYIN2012Y8CGMCCNo.5817接种于PDA固体培养基中，28~30℃恒温培养，待孢子大量生长时收获，用接种环将孢子刮下，用含有0.5~0.7%Tween80的生理盐水将孢子浓度调整至1.0×108CFU/mL，每30g固体发酵培养基接种5~7mL，于28~30℃恒温培养5~7d后收获；将固体发酵培养物与生理盐水混合均匀，室温浸泡，过滤、离心，取上清液经盐析、透析、凝胶层析分离，浓缩、冻干即得AFB1降解酶。本发明专利技术降解酶对AFB1具有较强的分解能力，其最高降解率达80.12%。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物
，具体涉及一种AFB1降解菌及降解酶。
技术介绍
自1960年英国火鸡暴发霉菌毒素疾病以来，世界各地对霉菌毒素中毒症进行了大量的调查研究。目前，已知有300多种真菌可产生霉菌毒素，主要的霉菌毒素包括黄曲霉素(aflatoxin)、玉米赤霉烯酮、赭曲霉素、单端孢烯和橘霉素等。这些毒素分布较广，已从大量的饲料原料和混合饲料中分离出。在各种霉菌毒素中，黄曲霉素被认为是最严重、毒性最大的一种，这是因为它可使肝中毒，并具有很强的抑制免疫，致癌、致突变和致畸性。根据联合国粮农组织(FAO) 2002年资料，世界上约有25%的谷物不同程度地受到霉菌毒素的污染，而危害饲料最严重的有黄曲霉、镰刀菌和青霉三种。这些霉菌主要污染玉米、小麦、大米、大麦、小米和燕麦等谷物，其中玉米和小麦的阳性检出率可分别高达45%和20%以上。动物在采食含有不同剂量黄曲霉毒素的日粮时，将表现为生长受阻、采食量减少、饲料利用率降低、被毛粗乱、精神沉郁、厌食、免疫抑制、肝损伤、黄疸、凝血病、贫血、出血性腹泻等不同症状，严重时可导致动物死亡。另外，饲料霉变后营养物质平均损失15%，甚至完全失去饲用价值。据报道，全球每年因霉毒素污染粮食和饲料所造成的经济损失高达数千亿美元。2011年12月24日，国家质量监督检验检疫总局公布了对全国液体乳产品进行抽检结果，蒙牛乳业(眉山)有限公司生产的一批次产品被检出黄曲霉毒素Ml超标140%，究其原因是由于奶牛食用霉变饲料所引发，一时轰动了全国，产生了严重的不良影响。因而，寻找有效的方法来降低或消除霉菌毒素的危害，变得越来越重要。专利技术内容本专利技术的目的在于提供一种AFB1 (全称黄曲霉毒素B1)降解菌及降解酶。为实现上述目的，本专利技术采取的技术方案如下 一种AFB1降解菌该降解菌为米曲霉(Aspergillus oryzane) A0YIN2012Y8,其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为=CGMCC No. 5817，保藏日期2012年02月28日，保藏单位地址北京市朝阳区北辰西路I号院3号。一种降解酶，按下法制备获得 (IXAFB1降解菌的固体发酵培养 将米曲霉(Aspergillus oryzane) A0YIN2012Y8 CGMCC No. 5817 接种于 PDA 固体培养基中，28 30°C恒温培养，待孢子大量生长时收获，用接种环将孢子刮下，用含有O. 5^0. 7 %Tween 80的生理盐水将孢子浓度调整至I. OX IO8 CFU/mL,按每30g固体发酵培养基接种5^7 mL进行接种，混合均匀后于28 3(TC恒温培养5 7 d后收获，得固体发酵培养物； (2),AFB1降解酶粗酶液的制备将步骤(I)获得的固体发酵培养物与生理盐水混合均匀，室温浸泡，浸泡完成后先过滤，之后将滤液离心，取上清液经盐析、透析纯化得AFB1降解酶粗酶液； (3)、凝胶层析分离AFB1降解酶粗酶液，浓缩、冻干即得AFB1降解酶。所述固体发酵培养基按如下方法制备按质量比(6 7): (2^3):(广2)称取麸皮、玉米、豆柏，麸皮、玉米与豆柏的总和为10，而后以固体水=1: (O. 8^1. I)质量比加水，搅拌均匀后，高压蒸汽灭菌。盐析、透析和凝胶层析均采用本领域常规操作方法，并且透析时，采用截留分子量为14 KDa的透析袋；凝胶层析时，所用凝胶为S印hadex G-100，分离范围为4 150 KDa0进一步，透析时，以10 mM、pH 7. 4的Tris-HCl为缓冲液；凝胶层析时，上样速度为3 4mL/5min，洗脱速度为3 4 mL/10 min,以O. 025 M KC1-0. I M Hac为洗脱液。本专利技术以腐烂的有机质作为AFB1降解菌的主要来源，制备的降解酶对AFB1具有较 强的黄曲霉毒素分解能力，其最高降解率达80. 12%。附图说明图I =AFB1降解菌提取基因组DNA电泳检测 图2 =AFB1降解菌基因组DNA扩增26S rDNA ITS区序列后电泳检测 图3 =AFB1降解菌ITS区测序结果 图4 =AFB1降解菌与同源性较高菌株的系统发育分析 图5 :凝胶层析分离AFB1降解酶后蛋白电泳检测 图6 :凝胶层析分离AFB1降解酶对AFB1的降解图。具体实施例方式AFB1降解菌的筛选用生理盐水将AFB1溶解制成浓度为100 Pg/L的溶液，而后均匀地涂布于PDA固体培养基上；按液固比mL/g，用生理盐水将腐烂的有机质进行IO5倍稀释，而后均匀涂布于表面含有AFB1的PDA固体培养基上，29°C恒温培养6d，每天观察菌落的变化情况，其中出现最早及长势较好的菌落，被认为目的单菌落(具有较强的黄曲霉毒素分解能力)A0YIN2012Y8，在中国微生物菌种保藏中心的登记编号为CGMCC No. 5817，其形态学特征为该菌株在在PDA培养基上生长迅速，固体发酵培养的24 h时既有菌丝大量生长，之后孢子大量产生，至72 h时培养基即被孢子包裹，呈黄褐色。挑取菌丝显微镜观察，菌丝有隔膜，分生孢子串生。AFB1降解酶，按下法制备获得 (IXAFB1降解菌的固体发酵培养 将AFB1降解菌A0YIN2012Y8 CGMCC No. 5817接种于PDA固体培养基中，29°C恒温培养，待孢子大量生长时(约6d)收获，用接种环将孢子刮下，用含有O. 5% (体积)Tween 80的生理盐水将孢子浓度调整至I. OX IO8 CFU/mL,按每30g固体发酵培养基接种5 mL孢子生理盐水溶液进行接种，混合均匀后于29°C恒温培养6 d后收获，得固体发酵培养物； (2),AFB1降解酶粗酶液的制备 按照固液比g/ml=l:2的比例将步骤(I)获得的固体发酵培养物与生理盐水混合均匀，室温浸泡I h (浸泡过程中间断搅拌)，浸泡完成后先用8层纱布过滤，之后将滤液在10000 Xg条件下离心5 min，在上清液中按80 %的饱和度加入硫酸铵(517 g/L)，边加边搅拌(持续时间约20 min)，之后静止4 h或过夜(4°C )，再在3000转/分下，离心15 min，取沉淀装于截留分子量14 KDa的透析袋中，置于10 mM Tris-HCl (pH 7. 4)的烧杯中，在磁力搅拌器的搅拌下透析，每30 min换10 mM Tris-HClCpH 7. 4),选用蒸懼水或自来水作对照，用10% (W/V)氯化钡溶液检查硫酸根离子的浓度，3 4 h透析完毕，透析袋内液体即为AFB1降解酶粗酶液，作凝胶层析用； (3)、凝胶层析分离AFB1降解酶粗酶液，凝胶层析所用凝胶为Sephadex G-100，分离范围为4 150 KDa 加样首先用f 2倍柱床体积的O. 025 M KC1-0. I M Hac洗脱液平衡柱子，使柱床稳定；上样前先将柱子上端的洗脱液全部吸出，用滴管将步骤(2)的粗酶液加入柱子顶部，打开出水口，待粗酶液渗入胶床后，关闭出水口，上样速度为3 mL/5min ； 洗脱柱上端用洗脱液充满后用3 mL/10 min的速度开始洗脱，采用收集管收集洗脱液(共用了 15个收集管，每管收集约4ml)，浓缩、冻干即得AFB1降解酶本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种AFB1降解菌，其特征在于：该降解菌为米曲霉（Aspergillus？oryzane）AOYIN2012Y8？CGMCC？No.5817。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：尹清强，左瑞雨，王平，刘俊熙，王潇，常娟，郑秋红，
申请(专利权)人：河南普爱饲料股份有限公司，河南农业大学，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。