本发明专利技术属于生物医药技术领域，具体涉及一种具有抗肿瘤活性的低抗凝肝素的制备方法。其以肝素为起始物进行完全脱硫酸化肝素的制备，进而进行N-位重新硫酸化，在此基础上采用PAPS再生系统，通过AST-IV、6-OST-1和2-OST组合酶法合成特定位点硫酸化肝素，最后再将以上肝素衍生物进行N-位脱硫酸化，最终得到具有低抗凝活性的专一抗肿瘤作用的肝素衍生物。这种肝素衍生物避免了普通肝素运用于肿瘤患者出现出血、血小板减少、骨质疏松等副作用，将有助于拓宽肝素类药物的临床应用范围。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物医药领域，具体涉及。
技术介绍
自1935年以来肝素作为抗凝药物已广泛应用于临床，但其除了抗凝血的作用以外，还具有促进脂蛋白脂酶和肝脂酶的释放，抑制补体激活，抑制血管生成和肿瘤生长，抗病毒等活性。近来发现肝素在抗炎以及抗肿瘤转移方面也发挥着重要作用。然而，由于肝素强烈的抗凝活性，限制了它的临床应用，对肝素进行化学或酶法修饰，可降低其抗凝活性， 但可增强其抗肿瘤作用。肝素的抗凝血活性来自于它的一个特殊的戊糖结构顺序，这个戊糖结构与抗凝血酶(AT-III)的结合可以导致其构象改变而被活化。对肝素这个特殊五糖结构的微小改变都会导致与抗凝血酶结合力的下降，从而显著降低其抗凝血活性。现有研究表明，肝素与 AT-III结合发挥抗凝血活性取决于其戊糖活性中心的数量。戊糖结构中N-位，3-0-位及 6-0-位硫酸基参与结合AT-III，与抗凝血活性有关；而2-0-位硫酸基和艾杜醛酸的作用尚不清楚，其中3-0-位硫酸基尤其重要，如果缺少3-0-位硫酸基，肝素的抗凝血活性则会降低1000倍以上。另有研究发现，N-位脱硫酸化肝素的抗凝、抗Flla、抗FXa活性分别是未修饰肝素的1.5%、0.9%、0. 1%，说明N-位硫酸基是肝素抗凝活性所必需具有的。几乎所有的研究都证实，肝素的抗肿瘤活性在很大程度上并不依赖于其抗凝血活性，主要取决于它的硫酸基取代情况(sulfation pattern，硫酸化图案)。据文献报道，肝素结构中葡萄糖胺6-0-位硫酸基的存在对于肝素的抗肿瘤和抗炎活性至关重要。Lapierre 等证实肝素结构中葡萄糖胺6-0-位硫酸基和N-位硫酸基对其抗肿瘤转移活性是必需的。 并有研究发现6-0-位和N-位脱硫酸化肝素可降低肝素的抗病毒活性，而2-0-位和3-0-位脱硫酸化肝素则基本无影响。陈金联等研究N-位脱硫酸肝素对人胃癌重度联合免疫缺陷 SCID小鼠转移模型肿瘤转移抑制、血管生成和表达的影响。陈明祥等发现N-位脱硫酸肝素通过抑制胃癌组织bFGF基因表达和血管生成，抑制肿瘤转移，而N-位脱硫酸肝素无明显出血等不良反应。国内外药物研究人员尝试用化学法对肝素的结构改造，化学法脱硫酸化可以在一定的程度上降低肝素的抗凝血活性，但由于缺乏选择性及硫酸化程度过低，导致抗肿瘤活性不明显。因此，选择性地去掉一些与抗凝相关的硫酸基，如3-0-位硫酸基；用酶法特异性的修饰与抗肿瘤活性有关的位点，如6-0-位硫酸基，>2-0-位硫酸基，就有可能合成具有低抗凝活性的专一抗肿瘤作用的肝素衍生物。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供。本专利技术的技术方案为以肝素为起始物，首先用化学法进行完全脱硫酸化肝素的制备，然后在PH 9. O的条件下用硫酸化试剂进行N-位重新硫酸化，在此基础上采用PAPS 再生系统，以6-0ST-1酶和2-0ST酶对特定位点进行有效的选择性硫酸化，合成得到具有低抗凝活性的专一抗肿瘤作用的肝素衍生物。本专利技术提出的具有抗肿瘤活性的低抗凝肝素的具体操作步骤如下采用不同的硫酸基转移酶组合来实现合成。首先从N-位硫酸化肝素出发，通过AST-IV和6-0ST-1合成 N-位，6-0-位硫酸化的衍生物；通过AST-IV和2-0ST合成葡萄糖醛酸2_0_位硫酸化的衍生物，并进一步通过AST-IV和6-0ST-1合成N-乙酰氨基葡萄糖6位硫酸化的衍生物，即得 N-位，6-0-，2-0-位硫酸化肝素。最后再将以上肝素衍生物在含10%甲醇的二甲亚砜溶液中反应2h，进行N-位脱硫酸化，最终得到6-0-位硫酸化肝素、2-0-位硫酸化肝素和6-0-， 2-0-位硫酸化肝素。本专利技术的独到之处有两点首先将对现有肝素药物进行完全脱硫酸化，最大限度地降低抗凝血活性中心的数量，从而大幅度降低其肝素的抗凝血活性。其次用6-0ST-1酶和2-0ST酶选择性修饰与抗肿瘤活性有关的硫酸基，提高其活性位点的电荷密度。这种肝素衍生物避免了普通肝素运用于肿瘤患者出现出血、血小板减少、骨质疏松等副作用。本专利技术将有助于拓宽肝素类药物的临床应用范围，因此其不仅具有科学研究价值，而且将具有较大的社会价值和经济价值。具体实施方式以下利用实施例进一步详细说明本专利技术，但不能认为是限定专利技术的范围。实施例一完全脱硫酸化肝素的制备Ig肝素钠溶于20mL去离子水中，过氢离子交换柱得到肝素酸溶液，用三丁胺 (tributylamine, TBA)将该溶液pH调至5. 5左右，冻干得到肝素三丁胺盐。将冻干粉溶于 25mL含10%甲醇的二甲亚砜溶液中，105°C,反应24h。反应结束,反应液用等体积水稀释后将其PH调至9，再用4倍体积的饱和乙酸钠乙醇溶液醇沉，透析，脱盐，冻干得到完全脱硫酸化肝素。经元素分析测定硫含量确定脱硫率达95%以上。实施例二N-位硫酸化肝素的制备完全脱硫酸化肝素溶于水，按质量比I : 2逐步加入三甲基铵三氧化硫共聚物 (trimethylamine sulfurtrioxide complex, TMA · S03), 55°C, pH 9 条件下反应 6h。反应结束调节PH至中性，透析、冻干得到N-位硫酸化的肝素。实施例三N-位，6-0-位硫酸化肝素的制备通常酶法硫酸化反应条件为Img N-位硫酸化肝素在20ml反应液中于室温下震荡 (300rpm)反应 6h。反应液包含 50mM Tris-HCl (pH 7. 2), 1% Triton X-100,1% BSA, ImM MgCl2, ImM MnCl2, ImM PNPS,40yM PAP，8mg 6-0ST-1 及 4mgAST_IV。100°C下加热反应液十分钟终止反应，离心分离得到上清液，将此上清液与两倍体积的2. 0%的NaCl水溶液混合， 对DEAE柱上样；依次以2. 0%的NaCl水溶液和3. 0%的NaCl水溶液进行梯度洗脱，收集第二次洗脱所得洗脱液。所得溶液用去离子水透析24小时，冻干得N-位，6-0-位硫酸化肝素的冻干粉。实施例四N-位,2-0-位硫酸化肝素及N-位,6-0-, 2-0-位硫酸化肝素的制备酶法硫酸化反应条件为Img N-位硫酸化肝素在20ml反应液中于室温下震荡(300rpm)反应 6h。反应液包含 50mM Tris-HCl (pH 7. 2), 1% Triton X-100,1% BSA, ImM MgCl2, ImM MnCl2, ImM PNPS,40yM PAP，8mg 2-0ST 及 4mg AST-IV0 100°C下加热反应液十分钟终止反应，离心分离得到上清液，将此上清液与两倍体积的2. 0%的NaCl水溶液混合， 对DEAE柱上样；依次以2. 0%的NaCl水溶液和3. 0%的NaCl水溶液进行梯度洗脱，收集第二次洗脱所得洗脱液。所得溶液用去离子水透析24小时，冻干得N-位，2-0-位硫酸化肝素的冻干粉。在此基础上将反应液调整为50mM Tris-HCKpH 7. 2), I % Triton X-100， I % BSA, ImM MgCl2, ImM MnCl2, ImM PNPS,40yM PAP，8mg 6-0ST-1 及 4mg AST-IV，制备得到N-位，6-0-，2-0-位硫酸化肝素。实施例五6-0_位硫酸化肝素、本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种制备具有抗肿瘤活性的低抗凝肝素的方法，是以现有肝素为起始物进行完全脱硫酸化肝素的制备，进而进行N？位重新硫酸化，在此基础上采用3’？磷酸腺苷？5’？磷酸硫酸(PAPS)再生系统，通过AST？1V、6？OST？1和2？OST组合酶法合成特定位点硫酸化肝素，最后再将以上肝素衍生物进行N？位脱硫酸化，最终得到具有低抗凝活性的专一抗肿瘤作用的肝素衍生物。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：滕丽萍，陈敬华，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：
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