抗肿瘤多肽及其制备方法和抗肿瘤应用技术

抗肿瘤多肽及其制备方法和抗肿瘤应用，本发明专利技术的目的是提供一种具有抗肿瘤功能的多肽及其制备方法，本发明专利技术的多肽，其结构包括内皮抑素N端锌离子结合位点的3个组氨酸结构，一个β折叠结构及串联的RGD序列。本发明专利技术公开了该多肽药物的化学合成方法，证明了该多肽具有抑制肿瘤增殖的作用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物技术制药领域的多肽类药物，及其制备方法和抗肿瘤应用。
技术介绍
肿瘤是一种多基因、多因素疾病，传统的肿瘤治疗包括手术、化疗、放疗等，主要直接以肿瘤细胞为靶点，存在术后残留，药物传递和穿透性问题，及对化疗、放疗不敏感、耐药等缺点。而肿瘤的生长是血管依赖性的，当肿瘤直径< 2_时，肿瘤细胞间通过弥散作用吸取营养，称为“血管前期”;当肿瘤进一步增大时，则需新生毛细血管来提供营养，称为“血管期”。血管新生对肿瘤的发生、发展和转移密切相关，因此，20世纪70年代初Folkman提出肿瘤抗血管疗法，这一设想为越来越多的证据所支持，并使这一领域成为肿瘤研究的热点 及肿瘤治疗的新策略。在多种血管生成抑制剂当中，内皮抑素(endostatin)是目前作用最强、实验效果最好的肿瘤血管生成抑制剂。内皮抑素是一种血管生成抑制因子，为20kd分子量蛋白质，由胶原蛋白XVIII的羧基末端的184个氨基酸残基组成。能特异性的抑制内皮细胞的增殖和血管的生成，抑制肿瘤的形成和转移。它的结构中有一个由11个精氨酸组成的碱性区域，这一区域对肝素有较强的亲和力，可能是发挥对血管内皮细胞抑制作用的关键结构区域。内皮抑素的分子结构揭示是一个高度折叠的分子构象，而内皮抑素N末端的无规则卷曲结构提示它的功能活性区可能最小化在N端的这几十个氨基酸中。1、3、11位的组氨酸和76位的天门冬氨酸构成了锌离子结合域，能够I : I结合锌离子，在抗肿瘤效应中发挥重要作用。血管的生成依赖原有的血管牙扩展，内皮细胞必须相互粘附并与细胞外间质(ECM)粘附以形成新生微血管。在这个过程中，整合素起着重要的作用，它参与内皮细胞的迁移和毛细血管样管道的形成。RGD序列是与肿瘤细胞粘连有关的ECM受体中主要粘附识别的氨基酸序列-Arg-Gly-Asp (精氨酰-甘氨酰-天冬氨酸，简称RGD)，人们合成了许多RGD多肽及衍生物，从而竞争、干扰肿瘤细胞与ECM的相互作用，达到抑制肿瘤转移的目的。实验表明含RGD重复序列多肽，在体外能明显抑制黑色素瘤细胞的侵袭、迁移，在体内抑制黑色素瘤的自发性和实验性肺转移的形成，作用较非重复的RGD肽强，而且这种增强作用与RGD序列的重复次数有关，重复次数越多，抗肿瘤转移作用越强。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种具有抗肿瘤功能的多肽及其制备方法，本专利技术的多肽，其结构包括内皮抑素N端锌离子结合位点的3个组氨酸，一个β折叠结构，及串联的RGD序列。其中所述内皮抑素N端锌离子结合位点的3个组氨酸位点基本序列为SEQ IDNO : I序列，其中Asp与Leu之间为3 8个氨基酸，优选为4 6个，其特征在于倒数第二位为 Pro,其他为 Ala、Phe> Trp> Gly、lie、Leu、Val、Gin。其中所述β折叠结构主要序列为SEQ ID NO :2序列，在Asn后为5 20个氨基酸，优选为6 10个，其特征在于第二位为Pro，并含有一个Gly，其他为Ala、SeiNMet、Leu、Gly、Asn、Gin、Thr、Tyr0其中所述串联的RGD结构基本序列为SEQ ID NO :3序列串联数为O 5个，优选为O 3个。本专利技术优选的多肽序列如下多妝序列I :His Ser His Arg Asp Phe Gln Pro Val Leu His Leu Val Ala LeuAsn Ser Pro Leu Ser Gly Gly Met,见 SEQ ID NO :4。多妝序列2 His Ser His Arg Asp Phe Gln Pro Val Leu His Leu Val Ala LeuAsn Ser Pro Leu Ser Gly Gly Met Arg Gly Asp,见 SEQ ID NO :5,多妝序列3 His Ser His Arg Asp Trp Gln Pro Val Leu His Leu Val Ala LeuAsn Ser Pro Leu Ser Gly Gly Met Arg Gly Asp Arg Gly Asp Arg Gly Asp,见 SEQ IDNO :6。·多妝序列4His Ser His Arg Asp Trp Gln Pro Val Leu His Leu Val Ala LeuAsn Ser Pro Leu Ser Gly Trp Met Arg Gly Asp Arg Gly Asp Arg Gly Asp,见 SEQ IDNO :7。其中特别优选的多妝序列为HisSer His Arg Asp Trp Gln Pro Val Leu HisLeu Val Ala Leu Asn Ser Pro Leu Ser Gly Trp Met Arg Gly Asp Arg Gly Asp Arg GlyAsp，其氨基酸序列见SEQ ID NO :7本专利技术多肽的制备方法可以采用多肽合成方法制备，也可以通过基因重组的方法制备，本专利技术优选的制备方法如下本专利技术的抗癌多肽优选采用反应条件温和、副反应少及产率高的Fmoc保护氨基酸固相合成法。以Fmoc-Asp (OtBu)-Wang为起始原料，用20%的哌啶(PIP)/N，N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液脱去Fmoc保护基，缩合剂为N，N- 二异丙基碳二亚胺(DIC)，从序列C端向N端方向依次接入保护氨基酸(Fmoc-AA)合成得32肽树脂，用裂解液裂解，无水乙醚沉淀出抗癌多肽的粗品，采用制备液相系统，反相C18填料精制纯化、脱盐后得精制液，经冻干后得成品，纯度98%以上。用本专利技术的抗癌多肽进行体外抑制内皮细胞增殖试验，评价对人血管内皮细胞ECV304的增殖抑制作用，计算细胞增殖抑制率。结果表明抗癌多肽对ECV-304细胞生长有一定的抑制作用。体内抑制肿瘤增殖试验评价对小鼠肝癌细胞H22小鼠移植瘤和对人胃腺癌SGC-7901裸鼠移植瘤生长的影响。在实验过程中采用的方法是取接种有H22肿瘤细胞的小鼠和接种人胃腺癌SGC-7901细胞的裸鼠，分别注射不同浓度的抗癌多肽、恩度，连续给药15 18d，停药后处死小鼠，观察肿瘤生长情况。结果表明，本专利技术的抗癌多肽有明显的抗肿瘤作用。肿瘤术后残瘤生长模型评价了小鼠S180肉瘤细胞和Iovo结肠癌细胞移植瘤术后残瘤生长的影响，试验结果显示，抗癌多肽具有抑制术后残留肿瘤生长的作用。在一定给药浓度下，本专利技术抗癌多肽的肿瘤抑制作用优于内皮抑素。本专利技术的优点在于增加了串联RGD序列数量，能够增强对于肿瘤的靶向性。另夕卜，由于本专利技术的序列中不含有或含有较少数量的Trp，采用多肽合成的方法，与基因重组方法相比更易精确定量。本专利技术的序列表说明SEQ ID NO :1，组氨酸位点序列，SEQ ID NO :2，β折叠结构序列，SEQ ID NO :3，RGD 结构序列，SEQ ID NO :4，本专利技术优选的多肽序列1， SEQ ID NO :5，本专利技术优选的多肽序列2，SEQ ID NO :6，本专利技术优选的多肽序列3，SEQ ID NO :7，本专利技术特别优选的多肽序列4。具体实施例方式以下说明并不构成对本专利的限制。本专利技术以SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :5、SEQ ID NO :6、S本文档来自技高网...

【技术保护点】
抗肿瘤多肽，其特征在于，含有内皮抑素N端锌离子结合位点的3个组氨酸序列，一个β折叠结构序列，及串联的RGD序列。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：王莹，李郑武，姜媛媛，孙磊，徐岩，李国军，刘贺煜，黄岩，李会成，陈玉军，张秀芹，黄宇红，王丽娜，李曲亮，高晶，曹翊婕，刘宇庭，
申请(专利权)人：哈药集团技术中心，
类型：发明
国别省市：