改进的RNA酶H和核酸扩增的检测制造技术

描述了一种可逆改进的“热启动”RNA酶H组合物，用于改善测试试样中核酸序列的CATACLEAVETM探针的检测。酶组合物的关键特征是能够在逆转录PCR循环过程中调节RNA酶H的催化活性。因此，在逆转录之前可以首先抑制RNA酶H的活性以最小化RNA:DNA异源双链引物的降解。在完成cDNA合成后，诱导RNA酶H的活性以促进切割和退火到逆转录-PCR产物内的靶DNA序列的CATACLEAVETM探针的荧光检测。所述可诱导的RNA酶H酶适用于在单一反应混合物中需要一步逆转录CATACLEAVETMPCR的高通量应用。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】改进的RNA酶H和核酸扩增的检测本申请要求在2010年5月25日提交的第61/347,984号美国临时专利申请的优先权，通过引用将该美国临时专利申请的全部内容包含于此。
本公开描述了一种改进的RNA酶H，用于改善RNA序列的实时逆转录-PCR检测。
技术介绍
研究基因表达的最广泛使用的技术之一是采用mRNA序列的第一链cDNA作为模板进行PCR扩增。结合逆转录-PCR技术测量PCR反应的动力学的能力使得以必需水平灵敏度来准确并精确测量靶RNA序列变得容易。具体地讲，诸如CATACLEAVETM核酸内切酶测定（在第5,763,181号美国专利中详细地描述；见图1）的荧光双重标记杂交探针技术允许实时的逆转录-PCR扩增的检测。通过在扩增反应中包括CATACLEAVETM探针连同RNA酶H来实现靶序列的检测。在逆转录-PCR扩增产物中与靶序列互补的CATACLEAVETM探针具有包括RNA序列和DNA序列的嵌合结构，并且在5′端和3′端两侧连接可检测标记，例如，FRET对标记的DNA序列。FRET对的荧光标记与淬灭剂的接近阻止了完整探针发射荧光。当探针与逆转录PCR产物退火时，产生能够通过存在于反应混合物中的RNA酶H切割的RNA:DNA复体。在退火探针的RNA部分内的切割导致荧光标记与淬灭剂的分离并导致随后的荧光发射。
技术实现思路
技术问题描述了一种可逆改进的“热启动”RNA酶H组合物，用于改善测试试样中核酸序列的CATACLEAVETM探针检测。酶组合物的关键特征是能够在逆转录PCR循环过程中调节RNA酶H的催化活性。因此，在逆转录之前可以首先抑制RNA酶H的活性以最小化RNA:DNA异源双链引物的降解。在完成cDNA合成后，诱导RNA酶H的活性以促进切割和退火到逆转录-PCR产物内的靶DNA序列的CATACLEAVETM探针的荧光检测。所述可诱导的RNA酶H酶适用于在单一反应混合物中需要一步逆转录CATACLEAVETMPCR的高通量应用。在一个实施例中，本专利技术包括热启动酶组合物，热启动酶组合物包含具有可诱导的RNA酶H活性的酶。酶可以具有热稳定的RNA酶H结构域，所述结构域可以与SEQIDNO:11、12、13或14的氨基酸序列具有至少70%、80%或90%、95%或99%的序列同源性。热启动组合物可以具有例如DNA聚合酶或逆转录酶活性的聚合酶活性。RNA酶H活性可以是热诱导的或pH诱导的。在一个实施例中，具有可诱导的RNA酶H活性的酶可以是PyrococcusfuriosusRNA酶HII、PyrococcushorikoshiRNA酶HII、ThermococcuslitoralisRNA酶HI、ThermusthermophilusRNA酶HI、大肠杆菌火球菌RNA酶HI或大肠杆菌火球菌RNA酶HII。可以通过化学修饰可逆地改进具有可诱导的RNA酶H活性的酶。在实施例中，可以通过对酶的诸如赖氨酸的氨基酸酰化或通过与具有大约0.2%至大约1%（w/v）的浓度的甲醛反应来对酶进行可逆地改进。在一个实施例中，热启动酶组合物还包括配体，其中，可通过配体与酶的结合抑制可诱导RNA酶H的活性或通过干扰酶与配体的结合诱导可诱导RNA酶H的活性。配体可以是热不稳定的。酶与配体的结合可以是非共价的。配体可以是对于具有可诱导RNA酶H活性的酶具有10-1M或更小的KD解离常数的小分子、肽或核酸。在一些实施例中，配体可以结合到RNA酶H结构域或可以诱导RNA酶H结构域的构象变化。配体可以是抗体、抗体片段、适体或螯合剂。抗体片段可以是Fab、Fab′、F(ab′)2、Fd、单链Fv或scFv、二硫键连接的Fv、V-NAR结构域、IgNar、胞内抗体、IgGDCH2、小体、F(ab′)3、四体、三体、二体、(scFv)2、单结构域抗体、DVD-Ig、Fcab、mAb2或scFv-Fc。RNA酶H的活性可以通过（1）将包含酶的溶液加热至大约90℃或更高的温度或者（2）将包含酶的溶液的pH降低至大约7.0或更低来诱导。所述溶液可以是包含靶核酸序列的聚合酶链式反应试样。酶和配体的结合可以是共价的。例如，配体可以是交联剂。在一个实施例中，本专利技术公开了一种扩增靶序列的方法，所述方法包括：提供扩增反应混合物；以及使扩增反应组合物进行至少一次扩增反应以形成至少一种扩增产物，并且测量得到的扩增产物的可检测标记，其中，扩增反应包括将反应组合物加热到大约90℃的温度的步骤，扩增反应混合物包含：包含靶DNA序列的试样；热启动酶组合物，包含DNA聚合酶和可诱导的RNA酶H活性；第一引物，包含与靶核酸序列的5′端互补的序列；第二引物，包含与靶核酸序列的3′端互补的序列；以及探针，结合到可检测标记并具有能被RNA酶H切割的组分。可以在大约95℃进行加热反应组合物的步骤。探针可以是包含一个或多个DNA序列部分以及RNA序列部分的寡核苷酸，其中，RNA部分以RNA序列的3′端和5′端结合到两个DNA序列中的每个DNA序列的方式设置在两个DNA序列之间。加热步骤可以通过破坏具有RNA酶H活性的酶和配体之间的结合来诱导RNA酶H的活性。配体可以是热不稳定的。在另一实施例中，本专利技术公开了检测试样中的靶核糖核酸序列的方法，所述方法包括：提供扩增反应组合物；开始靶RNA的逆转录以形成RNA:cDNA（注意：cDNA表示产物是双链DNA，而不是逆转录产物）双链；将反应组合物加热至大约90℃或更高的温度，由此激活可诱导的RNA酶H的活性以降解RNA:DNA双链的RNA配基；开始至少一个扩增反应以形成至少一种扩增产物，并且测量得到的扩增产物的可检测标记，扩增反应组合物包含：包含靶RNA序列的试样；热启动酶组合物，包含逆转录酶、DNA聚合酶和可诱导的RNA酶H活性，其中，RNA酶H的活性受配体抑制；探针序列，包含可检测标记并包含RNA酶H的切割序列；第一引物，包含与靶核酸序列的5′端互补的序列；以及第二引物，包含与靶核酸序列的3′端互补的序列。探针可以是包含一个或多个DNA序列部分以及RNA序列部分的寡核苷酸，其中，RNA部分以RNA序列的3′端和5′端结合到两个DNA序列中的每个DNA序列的方式设置在两个DNA序列之间。靶核糖核酸序列可以是逆转录酶病毒。可以在大约95℃进行加热反应组合物的步骤。加热步骤可以激活可诱导的RNA酶H的活性。配体可以是热不稳定的。在另一实施例中，本专利技术描述了具有在此描述的热启动酶组合物的微阵列。在又一实施例中，本专利技术公开了用于检测多个试样中的靶核糖核酸序列的方法，所述方法包括提供具有多个扩增反应组合物的微阵列以及在微阵列中对每个扩增反应组合物进行以下步骤：开始靶RNA的逆转录以形成RNA:cDNA双链；将反应组合物加热至大约90℃或更高的温度，由此激活可诱导的RNA酶H的活性以降解RNA:cDNA双链的RNA配基；开始至少一个扩增反应以形成至少一种扩增产物，并且测量得到的扩增产物的可检测标记，每个扩增反应组合物包括：包含靶RNA序列的试样；如权利要求18所述的热启动酶组合物，包含逆转录酶、DNA聚合酶和可诱导的RNA酶H活性，其中，所述RNA酶H的活性受所述配体抑制；探针序列，包含可检测标记并包含RNA酶H的切割序列；第一引物本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2010.05.25 US 61/347,9841.一种包含逆转录酶、DNA聚合酶和可诱导的RNA酶H的热启动酶组合物，所述热启动酶组合物用于在逆转录PCR中检测试样中靶核糖核酸序列的应用，其中，所述可诱导的RNA酶H使用顺式乌头酸酐或甲醛可逆地改进，并且所述可诱导的RNA酶H的RNA酶H活性在90℃或更高的温度被诱导。2.根据权利要求1所述的热启动酶组合物，其中，所述可诱导的RNA酶H包含具有SEQIDNO:10、11、12或13的氨基酸序列的RNA酶H同源区域。3.根据权利要求1所述的热启动酶组合物，其中，所述RNA酶H同源区域与SEQIDNO:10、11、12或13的氨基酸序列具有至少70％的同源性。4.根据权利要求2所述的热启动酶组合物，其中，所述RNA酶H同源区域与SEQIDNO:10、11、12或13的氨基酸序列具有至少80％的同源性。5.根据权利要求2所述的热启动酶组合物，其中，所述RNA酶H同源区域与SEQIDNO:10、11、12或13的氨基酸序列具有至少90％的同源性。6.根据权利要求1所述的热启动酶组合物，其中，所述可诱导的RNA酶H从激烈火球菌(Pyrococcusfuriosus)、堀越氏火球菌(Pyrococcushorikoshi)、栖热球菌(Thermococcuslitoralis)、嗜热栖热菌(Thermusthermophilus)或大肠杆菌中分离。7.根据权利要求1所述的热启动酶组合物，其中，所述DNA聚合酶是热稳定DNA聚合酶。8.根据权利要求1所述的热启动酶组合物，其中，所述RNA酶H活性通过改变包含酶的溶液的pH诱导。9.根据权利要求1所述的热启动酶组合物，其中，甲醛是以0.2-1w/v％浓度包含甲醛的溶液。10.根据权利要求1所述的热启动酶组合物，所述热启动组合物还包含配体，其中，所述可诱导的RNA酶H活性受所述可诱导的RNA酶H与所述配体的结合抑制并且通过干扰所述结合而诱导。11.根据权利要求10所述的热启动酶组合物，其中，所述配体是热不稳定的。12.根据权利要求10所述的热启动酶组合物，其中，所述可诱导的RNA酶H与所述配体之间的所述结合是非共价的。13.根据权利要求10所述的热启动酶组合物，其中，所述配体是对于所述可诱导的RNA酶H具有10-1M或更小的KD解离常数的小分子。14.根据权利要求10所述的热启动酶组合物，其中，所述配体是对于所述可诱导的RNA酶H具有10-1M或更小的KD解离常数的肽或核酸。15.根据权利要求10所述的热启动酶组合物，其中，所述配体结合到RNA酶H结构域。16.根据权利要求10所述的热启动酶组合物，其中，所述配体诱导所述RNA酶H结构域中的构象变化。17.根据权利要求10所述的热启动酶组合物，其中，所述配体是抗体、抗体片段、适体或螯合剂。18.根据权利要求17所述的热启动酶组合物，其中，所述抗体片段是Fab、Fab'、F(ab')2、Fd或scFv、二硫键连接的Fv、V-NAR结构域、IgNar、胞内抗体、IgGDCH2、小体、F(ab')3、四体、三体、二体、(scFv)2、单结构域抗体、DVD-Ig、Fcab、mAb2或scFv-Fc。19.根据权利要求8所述的热启动酶组合物，其中，通过将包含所述可诱导的RNA酶H...

【专利技术属性】
技术研发人员：张文腾，詹森·欧普迪克，
申请(专利权)人：三星泰科威株式会社，
类型：
国别省市：