一种利用化学注射不育技术测定昆虫精子竞争结果的方法，本发明专利技术涉及一种利用化学注射不育技术来进行精子竞争研究的方法，其原理是经化学不育剂注射的雄性的精子仍能使卵正常受精，但受精卵在发育过程中（孵化前）会死亡，从而可以让雌性与一个注射过的雄性和一个野生雄性交配，然后根据受精卵的死亡率来确定两个雄性各自的受精比例，从而达到精子竞争研究的目的。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种利用化学注射不育技术来进行精子竞争研究的方法，属于动物生理学、行为学领域。
技术介绍
精子竞争(发生在两个以上的雄性的精子相互竞争使一个雌性的卵受精)，是精子型态与功能以及生殖行为研究的重要内容，对物种进化研究有着重要的意义。当一个雌性与两个雄性交配后，测定每一个雄性的受精比例是研究精子竞争机制的有效手段。有三种方法用来测定受精比例不育雄性技术，表型特征，及DNA标记。辐射法不育雄性技术因其相对简便而最常被采用，其原理是经辐照的雄性的精子仍能使卵正常 受精，但受精卵在发育过程中(孵化前)会死亡，从而可以让雌性与一个辐射过的雄性和一个野生雄性交配，然后根据受精卵的死亡率来确定两个雄性各自的受精比例。然而，用辐射法来节育雄性受到设备及费用的限制。化学不育剂四乙烯五胺(Tepa 4 Λ"，，Λ"，，-triethylenephosphoramide;C6H12N3OP)及其衍生物塞替派(Thiotepa 4 Λ"，，Λ"，，- triethylenethiophosphoramide;C6H12N3PS ;比t印a更稳定)也常被用来节育昆虫。这类不育剂可作用于DNA，使鸟嘌呤和腺嘌呤发生交联从而阻止DNA合成及细胞分裂。因而，用化学不育剂处理过的雄性仍然产生能够使卵正常受精的精子，但被这些精子受精的卵在胚胎发育过程中会死亡，从而卵不能孵化。化学不育法因此有可能代替辐射法处理昆虫用于精子竞争研究。在使用化学不育剂时，剂量及处理方法都是必须认真考虑的，其目的是在最小的副作用下完全使雄性的精子不育。可选择的处理方法主要有饲喂法和注射法。饲喂法相对简单，但不容易定量，注射法可以很好定量并易于重复，但可能对被注射的个体带来伤害从而影响精子竞争测定结果。申请人在2010年采用塞替派水溶液饲喂法使地中海粉螟雄性节育，并证明了化学不育法可以用于精子竞争研究。然而经过后来的大量研究发现，饲喂法存在不稳定、不易控制及无法定量从而干扰实验结果的缺点。基于上述，本专利技术采用塞替派水溶液注射法，建立了一种快速可靠的测定昆虫精子竞争结果的方法。经文献检索，未发现与本
技术实现思路
相同文献的公开报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了克服现有研究方法的不足，采用塞替派水溶液注射不育法，建立一种快速并且可靠的测定精子竞争结果的方法，促进精子行为及精子竞争的研究。本专利技术采用的技术方案具体如下 一、注射塞替派使雄虫不育化学注射不育的原则是在最小的副作用下完全使雄性的精子不育，即注射后雄性在交配能力、精子活力、受精力上与野生雄性没有显著差异，但是被其受精的卵100%在孵化前死亡。塞替派对人是有毒的，因此所有的处理都在通风橱里进行，并且配戴手套。将雄虫用二氧化碳轻度麻醉后，用玻璃毛细管针注射器从雄虫腹面柔软处进行注射，每只雄虫注射塞替派(SIGMA-ALDRICH，Co. , USA)的剂量为O. 001 O. 5mg (可以配制成水溶液注射)，注射过的雄性被单独关养5 72h (使塞替派发挥作用)备用(注射剂量及注射后的单独关养时间根据昆虫种的不同进行调整)，不同昆虫种的最适注射剂量及注射后的单独关养时间及有效节育时间可按下述方法确定I.给雄性注射不同的剂量，分别关养一定的时间，然后分别与野生未交配过的雌虫交配，之后每天计数产卵、受精及孵化率，从而确定可以使雄虫精子完全节育的最低剂量及注射后有效时间。2.用一只雌虫与按上述优化的注射条件注射过的雄虫和一只未注射过的雄虫单独关养，观察交配情况，并通过精包精子计数、雌性生殖道精子量的动态变化、体外精子游动测定，以确定该注射条件对雄性交配能力、精子活力和受精力是否有影响。 二、精子竞争结果的测定让雌虫与上述注射过的或野生雄虫交配，并根据孵化率来确定各个雄虫的受精比例。用了 4个处理(I)雌性先与处理过的雄性交配再与未处理过的雄虫交配(T-U) ; (2)雌性先与未处理过的雄性交配再与处理过的雄虫交配(U-T) ; (3)雌性先后与两个处理过的雄虫交配各一次(T-T)，(4)雌性先后与两个未处理过的雄虫交配各一次(U-U)。根据不同研究目的可以调整两次交配中间间隔时间，交配了两次的雌性被单独关养以记录孵化率。第二雄性所占的受精卵的比率可按下述公式得到P2 = I/ k — (Xu-U ~~ Χτ-υ) / (-^T-U ~~ Χτ-τ) h — (Χυ-τ - Xt-t) / (^u-U - Χυ-τ) 其中P2 =第二雄性所占的受精卵的比率，Xuhi和Xt_u = U-U的孵化率和T-U的孵化率；Χτ_τ和Χυ_τ = T-T和U-T的孵化率。则第一雄性的受精卵的比率P1 = I - P2 上述结果的可靠性可以用如下公式进行检验 即如能得到Xt-U ^ (100 - Xift) X Xu,则表明化学注射处理过的精子与正常精子一样具有相同的竞争力，同时也说明用该化学注射处理法进行精子受精比例测定得到的结果是可靠的。本专利技术所述方法具有快速、稳定及可靠等优点，可用于昆虫精子行为及精子竞争的研究。具体实施例方式以下是本专利技术的实施例，但本专利技术的内容并不局限于此，同样适用于其它昆虫的精子竞争研究等。实施例I :斜纹夜蛾精子竞争结果测定 一、注射条件的优化新羽化的雄虫(〈12 h)用二氧化碳轻度麻醉后，用玻璃毛细管针注射器从雄虫腹面第三腹节处进行注射，每只雄虫注射塞替派(SIGMA-ALDRICH，Co., USA)的剂量为O.02 O. 03mg (配制成1%的水溶液注射2 3 μ I)。注射过的雄性被单独关养5 72h备用。该注射剂量及注射后单独关养时间是经过多次测试及优化后适合于斜纹夜蛾的处理条件，实验处理后的斜纹夜蛾雄性在交配能力、精子活力、受精力上与野生雄性没有显著差异，但是被其受精的卵100%在孵化前死亡，因此符合精子竞争测定的要求。剂量及处理方法的优化原则是在最小的副作用下完全的使雄性的精子不育。注射条件优化方法具体为I.给雄性注射不同的剂量，分别关养一定的时间，然后分别与野生未交配过的雌虫交配，之后每天(该种成虫寿命约IOd)计数产卵、受精及孵化率。结果表明注射剂量为 O.02 O. 03mg塞替派在关养5 72h内均能使卵正常受精(与野生型对照)，剂量太低不能完全使雄性节育，剂量太高被注雄虫死亡率有明显升高，注射后时间太短药效不能完全发挥作用使雄性不能完全节育，时间太长药效会降低同样不能使雄性完全节育。2.用一只雌虫与按上述优化的注射条件注射过的雄虫和一只未注射过的雄虫单独关养，观察交配情况表明该注射方法对雄虫竞争力没有显著影响。通过精包精子计数、雌性生殖道精子量的动态变化、体外精子游动测定表明该注射方法对雄虫射精量、精子活力和迁移力没有显著影响。从而确定注射剂量为O. 02 O. 03mg塞替派、关养5 72h的节育方式满足不育法测定该种精子竞争结果的要求。三、精子竞争结果的测定让雌虫与上述注射过的或野生雄虫交配，并根据孵化率来确定各个雄虫的受精比例。用了 4个处理(I)雌性先与处理过的雄性交配再与未处理过的雄虫交配(T-U) ; (2)雌性先与未处理过的雄性交配再与处理过的雄虫交配(U-T) ; (3)雌性先后与两个处理过的雄虫交配各一次(T-T)，(4)雌性先后与两个本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种利用化学注射不育技术测定昆虫精子竞争结果的方法，其特征在于将化学药物注射雄性不育技术运用于昆虫精子竞争结果的测定。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：徐进，叶辉，俞虹，
申请(专利权)人：云南大学，
类型：发明
国别省市：
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