本发明专利技术公开了一种检测禽流感病毒的RT-HDA试剂盒及引物。所述检测禽流感病毒的引物为序列表SEQ?ID?No：1和序列表SEQ?ID?No：2所示的寡核苷酸序列。本发明专利技术首次将新型恒温扩增技术HDA应用于禽流感病毒的检测中，与AIV现有的检测方法相比：①HDA检测方法更快、更便捷，安全可靠。传统的病毒分离和血清学方法耗时较长，且存在生物安全危险性；HDA方法模仿体内天然的复制机制，安全性高，且反应快速，最多仅需2h即可完成检测；②与PCR相比不需要PCR仪，设备要求简单，仅需要一台水浴锅，从技术层面上讲更便于掌握和操作，更便于在条件不足的地区推广应用，更有利于对禽流感病毒的诊断和监控。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种检测禽流感病毒的RT-HDA试剂盒及引物，属于检验检疫领域。
技术介绍
禽流感(Avian Influenza，AI)是由正黏病毒科、流感病毒属、A型流感病毒引起的禽类感染和/或疾病综合症。禽流感历史悠久，第一次发现是1878年,Perroncito首次报道禽流感在意大利发生，已被国际兽医局(OIE)列为A类烈性传染病，世界卫生组织(WHO)认为Al是对人类造成潜在威胁的最主要的疾病之一，我国也将高致病性禽流感(HPAI)列入一类动物传染病进行防制。近些年来，我国很多地区都存在禽流感的流行，给养禽业带来不同程度的打击，迄今为止已经发生多起高致病性禽流感感染人致死的事件，对养殖业发展和人类健康造成巨大威胁。目前，全世界已有15个国家和地区发现禽流感人类感染病 例，死亡率高达60%以上。因此，建立禽流感快速检测技术，将对禽流感的监测与防控发挥重要作用。目前，我国使用的禽流感检测标准有2项行标和7项国标,主要检测方法有病毒分离、各类血清学试验及免疫学试验(琼扩、血凝血抑、ELISA)、分子生物学检测方法(RT-PCR和荧光RT-PCR)等。但是，每种检测方法均存在一定的局限性。传统的病毒分离和血清学方法繁琐耗时，不适于流行病学普查和高通量口岸检疫。PCR和荧光PCR方法已经得到广泛应用，并在疾病检测和过境检疫中发挥了重要作用。但是，传统的PCR技术仍然存在一些不足需要昂贵的设备，尤其是荧光PCR仪造价不菲；容易受到多种因素的影响；扩增时间往往需要几个小时。上述问题使得传统的PCR技术难以在基层推广应用，不利于疾病的“早发现、早报告、早处理”。近年来，分子诊断技术日新月异，产生了多种新型分子扩增技术，推动着分子诊断技术向操作简单、仪器设备要求不高的方向发展。其中，依赖解旋酶恒温基因扩增技术(Helicase-Dependent Isothermal Amplification,HDA)是 2004 年 BioHelix 的研究人员模拟动物体内DNA的复制机制专利技术的一种新的体外恒温扩增技术。该技术利用DNA双链解旋酶打开双链DNA，同时在单链结合蛋白(SSB)和DNA聚合酶的作用下，扩增靶片段，实现目的基因的体外扩增。HDA技术与其他基因扩增技术比较，具有如下优势I.与PCR技术相比，HDA技术模仿自然界DNA合成方式，凭借DNA解旋酶解开双链并完成扩增，而传统PCR是通过变性-退火-延伸过程的多次循环实现。由于原理的不同，使得HDA的优点尤其突出①HDA反应在同一温度下进行，因而不需要昂贵的PCR仪，有利于在基层实验室推广应用。②由于只用一种温度扩增使得HDA反应时间明显缩短，仅需Ih左右。③HDA技术采用去除了 5’ -3’外切酶活性的BstDNA聚合酶，该酶兼具耐高温性、高效扩增反应性、极好的条带均一性及高准确性等特点，不易引起非特异性扩增，使得HDA技术具有更高的特异性和敏感性。2.与其他恒温扩增技术相比，HDA是一种真正意义上的恒温基因扩增方法。例如SDA、LAMP等均需要热变性，而HDA不需此步即可完成反应。此外，尽管HDA的反应体系组稍显复杂，但操作并不繁琐。尤其HDA技术的引物设计简单。SDA技术需要四条引物，靠一组限制性酶消化和置换合成达到扩增目的，同时还需经修饰过的dNTP作底物，而且靶序列的复杂性也限制了其应用范围。TMA技术需要三种酶来完成恒温基因扩增，反应复杂性也限制其使用范围。LAMP技术虽具有简便、快速、高效、特异性很强等优点，但引物设计复杂，难度较大，且对识别靶序列要求极高目的序列长度限制在200bp左右，从中设计的四至六条引物Tm互有差别，且能识别6个不同的区域。而HDA技术的引物设计与常规PCR方法相同，仅需两条普通引物即可。总之，与同类新型PCR技术相比，HDA技术更简单，更有效，是一种崭新的基因扩增方法，极具应用价值和市场前景。据最新研究报道，现有的HDA技术还包括一种不仅可扩增大分子DNA片段，还可直接扩增完整环状质粒DNA的环HDA法(The circular heli case-dependentamplification, cHDA)。利用cHDA的特异性扩增环状DNA能力,可直接从临床标本和特定的病原体中检测含有环状DNA的病毒等。HDA技术与荧光标记技术相结合还可以实现实时检测。研究表明，HDA技术能够扩增微生物基因组DNA、病原DNA和RNA、质粒DNA和cDNA等。HDA方法扩增能力强，现用的Uvrd系统扩增可达100多万倍，能够从基因组DNA中检测到低于10个拷贝的靶基因。综上所述，HDA技术是一种不可比拟的真正实用的恒温基因扩增方法，有望成为一种重要的诊断工具。目前，国际上对于HDA技术的研究尚处于起步阶段，国内外还没有关于HDA检测动物病毒的研究。我们将首次建立起快速检测禽流感病毒的HDA技术。该项研究成果将成为动物疫病分子诊断领域的突破性技术，是动物传染病检疫技术体系的进一步完善和发展。HDA技术的建立将真正实现简单、便捷的临床和实验室诊断，适用于基层检疫，可全面提升口岸检疫的检测能力，缩短检疫时间，真正实现高通量检测，为我国禽流感的有效防制作出重大贡献。
技术实现思路
本专利技术要解决的第一个技术问题是提供一组作为引物使用的、检测禽流感病毒的寡核苷酸序列。本专利技术要解决的第二个技术问题是提供一种特异、灵敏、高效的检测禽流感病毒的试剂盒。为解决第一个技术问题，本专利技术采用以下技术方案一组检测禽流感病毒的引物，为序列表SEQ ID No : I和SEQ ID No :2所示的寡核苷酸序列，详见表I。表I.引物序列权利要求1.一组检测禽流感病毒的引物，其特征在于，该引物序列如序列表SEQ ID NO :1至SEQID NO :2所示，其中SEQ ID NO :I为检测禽流感病毒的引物I，SEQ ID NO :2为检测禽流感病毒的引物II。2.一种检测禽流感病毒的RT-HDA试剂盒，其特征在于，由以下组分组成 (1)TriZol 裂解液； (2)RT-HDA反应液，其包括HDA缓冲液、MgS04、NaCl、dNTP、引物I、引物II ;其中，所述引物I的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO: I所示，引物II的核苷酸序列如序列表SEQ IDN0:2所示； (3)酶混合物，其包括DNA解旋酶，BstDNA扩增酶和反转录酶； (4)无RNA酶的灭菌纯化水； (5)阴性对照无核酸灭菌水； (6)阳性对照为体外转录的非感染性RNA片段，其对应的DNA序列为序列表SEQIDNo. 3所示的核苷酸序列。3.根据权利要求2所述的检测禽流感病毒的RT-HDA试剂盒，其特征在于所述反转录酶为ThermoScript反转录酶。4.根据权利要求2所述的检测禽流感病毒的RT-HDA试剂盒，其特征在于所述RT-HDA反应液为 IXHDA 缓冲液、4. OmM MgSO4,40mM NaCl.O. 21mM dNTP、IOOnM 引物 I 和 IOOnM 引物II。5.一种检测禽流感病毒的PCR方法，其特征在于，包括如下步骤 (1)提取样品RNA； (2)对提取的样品RNA进行RT-HDA扩增； (3)反应条件:65°C，9(Tl20mi本文档来自技高网...
【技术保护点】
一组检测禽流感病毒的引物，其特征在于，该引物序列如序列表SEQ？ID？NO：1至SEQ？ID？NO：2所示，其中SEQ？ID？NO：1为检测禽流感病毒的引物I，SEQ？ID？NO：2为检测禽流感病毒的引物II。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：蒲静，张伟，刘环，乔彩霞，高志强，汪琳，谷强，
申请(专利权)人：中华人民共和国北京出入境检验检疫局，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。