本发明专利技术提供了猪传染性胃肠炎TGE的RT-LAMP检测方法，包括如下具体步骤：1）根据GenBank中TGEVN基因的保守区域，用在线软件设计LAMP引物；2）制备病毒液，-80℃备用；3）提取TGEV的RNA；4）以步骤3)所得的TGEV的RNA为模板，进行RT-LAMP反应；5）琼脂糖凝胶检测RT-LAMP反应结果。本发明专利技术所述猪猪传染性胃肠炎TGE的RT-LAMP检测方法与传统方法相比，具有以下优点1.操作简单。2.快速高效。3.高特异性。4.高灵敏度。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术适用于临床和基层实验室快速、准确地诊断猪传染性胃肠炎。
技术介绍
猪传染性胃肠炎(TGE)是由猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)引起的一种高度接触传染性肠道疾病，临床上以病猪呕吐、严重腹泻和失水为主要特征，不同品种、年龄的猪只都可感染发病，尤以两周龄以内仔猪、断奶仔猪易感性最强，致死率高，可达100%。该病是 一种世界性疾病，给畜牧业生产带来巨大的经济损失，早发现、早确诊对该病的防治意义重大。要做到早确诊就需要快速、敏感、特异的诊断方法。目前，检测TGEV的常规方法主要有病原学检测，包括病毒的分离鉴定、电镜检测、免疫荧光法和免疫过氧化物酶法等；血清学检测，包括血清中和试验、酶联免疫吸附试验(ELISA) 等；分子诊断技术，包括核酸探针杂交技术、聚合酶链式反应(RT-PCR)技术、多重RT-PCR和RT-nPCR方法等。作为传统的检测方法，TGEV的病原学检测存和血清学检测在着许多问题。 TGEV的分离只能在实验室进行，需要较高的技术水平和较先进的实验条件，操作困难，所需周期长，且TGEV与多种病毒接种细胞后CPE相同或相似，如诸呼吸道冠状病毒、猪流行性腹泻等，因此病毒分离方法显得并不可靠。病毒分离以后为了最终确认该猪组织中的病毒，还需借助其它得检测手段，如特异性抗TGEV血清做中和试验、免疫荧光(IF)等方法进行最终的鉴定M ;通过电镜观察病毒证明，在感染猪肠内容物和粪便中可以发现有TGEV的存在。实践证明免疫电镜(IEM)比常规电镜(EM)的检测效果更好，前者对检测临床样品或细胞培养物中的TGEV更为敏感，并可以提供病毒血清学的鉴定。但是最终还必须使用特殊的单克隆抗体检测。虽然该两种方法可以作为确诊该病的最终诊断依据，但是成本高、过程复杂、操作时间长。TGEV抗体的血清学方法检测，最常用的是SN试验，其中微量滴定板和抑制试验和蚀斑减数试验使用最为普遍m。已经建立的间接荧光抗体试验方法不如VN试验的敏感和可靠。相对敏感的被动血凝试验则需要浓缩纯化病毒及致敏红细胞。其他发展的血清学试验包括检测免疫球蛋白特异性抗体的间接免疫过氧化物酶试验、放射性免疫沉淀试验和“似及对流免疫电泳” 。但是，该实验法存在严重的非特异性。酶联免疫吸附实验(ELISA)是当前应用最广泛的一种免疫学检测方法，己发展了间接ELISA、双抗体夹心ELESA、竞争ELISA和阻断ELISA等。不同的ELISA方法可检测TGEV抗体或抗原。ELISA方法是常用检测方法，但由于单克隆抗体是针对特定抗原位点，而不同TGEV株这些抗原位点有差异，导致某些样品的漏检。分子诊断技术的蓬勃发展给TGEV的检测提供了更多的方法，如RT-PCR、基因芯片技术M、核酸序列依赖性扩增(NASBA)、实时荧光RT-PCR、错配扩增突变试验(MAMA)等，同样，诸多新型核酸扩增技术法均存在不同的缺点，例如试验周期较长、操作繁琐、灵敏度不高、特异性不强、准确性较低、易受检测材料限制等，应用于临床鉴别诊断的实用意义不大，不适合在基层实验室推广应用。因此，建立一种快速简便的、适用于临床和基 层实验室的检测方法十分重要。环介导等温核酸扩增技术(LAMP)最初是Notomi等设计并应用于病毒及其他病原体基因的检测，其特点是针对靶基因的不同区域设计4种特异引物，利用一种链置换DNA聚合酶(Bst DNA polymerase),于恒温条件下几十分钟内即可完成核酸的扩增反应，具有较高的敏感性和特异性。逆转录环介导等温核酸扩增技术(RT-LAMP)是在LAMP反应体系中加入一定量的逆转录酶从而实现RNA到DNA的一步扩增。RT-LAMP方法具有独特的引物设计方案，针对靶基因六个区域而设计出四条引物，进而对自身进行链置换扩增，扩增过程中，任何一个不匹配将导致反应无法进行，几乎不可能出现非特异性扩增;同时，在链置换反应过程中，不需要模板的热变性、退火和长时间温度循环等过程，只需要恒温几十分钟即可完成，且扩增效率极高，一般能检测到10拷贝以下的样品，故该方法具有高特异性和高敏感性的特点，对于低浓度的病毒或无症状的病毒携带者的检测敏感性较常规PCR高。RT-LAMP是恒温扩增反应，反应温度对LAMP的影响方式与常规PCR不同，它不作用于DNA而作用于Bst酶。在Bst酶活性范围内温度对LAMP的影响不大，但实验过程中需综合考虑各方面因素，确定最合适温度。RT-LAMP法的检测方法有肉眼观察法、荧光染料显色观察法、琼脂糖凝胶电泳法和浊度仪检测法四种。在LAMP反应过程中，可以通过产生的副产物焦磷酸镁白色沉淀的产生来肉眼直接判断扩增反应是否进行。有时，通过肉眼观察白色沉淀来检测会存在一定的误差，所以也可通过添加荧光染料，如溴化乙锭(EB)、SYBR GreenI等进行染色，来检测扩增是否发生；基于同样的原因，日本荣研株式会社利用LAMP反应过程中产生焦磷酸镁白色沉淀，研制出专门用于LAMP检测的实时终点浊度仪，以实现对LAMP扩增过程的实时监控，使扩增和检测同时完成；由LAMP原理可知，LAMP反应的最终扩增产物是茎环DNA组成的混合物，即有若干倍茎长度的茎环结构和类似花椰菜的结构，因此，LAMP扩增产物在2%的琼脂糖凝胶糖上呈现的是典型的梯状条带。以方便观察为原则，绿色荧光检测法简便、快速和可靠，用肉眼即可对结果进行判定，完全可以满足临床和基层部门检测猪传染性胃肠炎病毒的需要，具有广泛的应用前景。RT-LAMP与常规PCR相比，具有如下优点它要求四种引物在靶基因上的不同部位完全匹配才能进行扩增，具有很高特异性；等温扩增，省去了昂贵的热循环仪的费用；多引物且不用控制温度变化促使链置换反应使靶基因利用酶反应系统搞笑扩增，靶核酸序列呈指数扩增，扩增效率高。.综上所述，RT-LAMP方法具有操作简便可行、结果判断简单等多方面的有点，故本法经面世就被应用到很多方面，包括人类、动物和植物致病微生物的检测、动物胚胎性别和转基因食品的检测等_。近年来已有一些成功应用该技术对病原体进行检测的文献报道，但尚未见将其应用于TGEV检测的研究。建立针对TGEV的快速灵敏特异的RT-LAMP检测方法，为野外及基层实验室检测TGEV提供无需特殊仪器、更为简便、快速、特异的方法。
技术实现思路
鉴于现行TGEV检测方法不适用于临床和基层部门实验室，而RT-LAMP与其它检测方法相比，具有简便、快速、特异等优势，不需PCR仪，在水浴锅中即可完成扩增，特别适合于基层实验室推广使用。本研究应用环介导等温扩增技术建立了猪传染性胃肠炎RT-LAMP检测方法，旨在为野外及基层实验室检测TGEV提供无需特殊仪器，更为简便、快速、特异的方法。本专利技术的技术方案如下猪传染性胃肠炎TGE的RT-LAMP检测方法，包括如下具体步骤 1)根据GenBank中TGEVN基因的保守区域，用在线软件设计LAMP引物如下FIP 5’ GGCATCTGCATGAGGTCCAGACGTAAAGAGCTTCCTGAA3’BIP 5’ CAAGGATGGTGCCATGAACAAAGCTTTGGATTCATTATTAGCAC3’ F3 5， GCTATCGCATGGTGAAGG3， B3 5’ CAAGTTGAAATTCGCCTGG3本文档来自技高网...
【技术保护点】
猪传染性胃肠炎TGE？的RT？LAMP检测方法，其特征在于，包括如下具体步骤：1）根据GenBank中TGEV？N基因的保守区域，用在线软件设计LAMP引物如下：？？FIP？？5’GGCATCTGCATGAGGTCCAGACGTAAAGAGCTTCCTGAA3’BIP？5’CAAGGATGGTGCCATGAACAAAGCTTTGGATTCATTATTAGCAC3’F3？？？？5’GCTATCGCATGGTGAAGG3’B3？？？？5’CAAGTTGAAATTCGCCTGG3’；2）用常规方法将PK？15细胞传代培养，待其长成单层，将TGEV？Purdue株冻干毒用DMEM稀释后接种于细胞上，在37℃，5%？CO2？培养箱中吸附1h后，弃病毒液，加入DMEM维持液，重新置于37℃，5%？CO2培养箱中，待细胞出现明显病变，刮取细胞收获病毒液，？80℃备用；3）提取？TGEV的RNA；4）以步骤3)所得的TGEV的RNA为模板，按照下述条件进行RT？LAMP反应：10×Bst？buffer？2.5μL、AMV（5U/μL）0.5μL、Bst？DNA？聚合酶8U、Betaine（1mol/L）3μL、Calcein（250μmol/L）3μL、MnCl2？（25mmol/L）0.5μL、MgSO4（100mmol/L）0.5μL、BIP（10mmol/mL）3μL、FIP（10mmol/mL）3μL、LB（10mmol/mL）2μL、F3（10mmol/mL）0.5μL、B3（10mmol/mL）0.5μL、dNTPs？（10mmol/L）3μL、模版RNA（7.28μg/μL）2μL，用去离子水补足25μL；反应条件为：62℃1h，80℃10min；5）？可视化观察RT？LAMP反应结果;6）琼脂糖凝胶验证可视化RT？LAMP反应结果。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：贺东生，陈瑞爱，钟望，刘好鹏，张显浩，裴仉福，唐绪，汤钦，
申请(专利权)人：广东大华农动物保健品股份有限公司，肇庆大华农生物药品有限公司，
类型：发明
国别省市：
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