本发明专利技术涉及一种检测猪博卡病毒(PBoV)的LAMP试剂盒及其制备方法，所述试剂盒包含用无菌双蒸水配制的LAMP反应试剂，每个反应加入24μLLAMP反应试剂，其中LAMP反应液24μL包含的组分及浓度分别为：10U的BstDNA聚合酶，2.5μL的聚合酶缓冲液(200mM?Tris-HCl(pH?8.8)，100mM?KCl，100mM(NH4)2SO4，1％Triton?X-100)，150mmol的MgSO4，25mmol的甜菜碱，30mmol的dNTP，5pmol的引物P1，5pmol的引物P2，40pmol的引物P3，40pmol的引物P4。本发明专利技术的有益效果为：本发明专利技术可以高效快速的对可疑PBoV感染进行检测，且检测手段简单，不需要昂贵的实验仪器，适合在临床疾病诊断中推广。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于兽用生物制品领域，具体涉及。
技术介绍
猪博卡病毒(Porcine bocavirus, PBoV)是一种无包膜的单链DNA病毒，归属于细小病毒科博卡病毒属。2005年，Allander首次从患呼吸道感染的婴幼儿中分离得到人的博卡病毒。自此以后，世界各地纷纷在呼吸道，血液，粪便，尿液等处发现博卡病毒。有呼吸道病症的患者感染博卡病毒的几率明显比正常人高。2009年，在瑞典猪群中偶然发现猪群中存在PBoV，2010年我国猪群中也检测到PBoV。在临床上博卡病毒主要导致人、牛、猪 等动物的下呼吸道感染和腹泻。自2010年4月至今，韩国、泰国；我国的广东、福建、广西、江西、湖北、河北和山东规模化猪场的仔猪陆续发生严重腹泻哺乳仔猪多在出生后2-3天发生呕吐，随后发生剧烈腹泻，死亡率较高，有的地区出现腹泻后死亡率达到100%。而母猪和育肥猪无明显症状。按照流行性腹泻、传染性胃肠炎和轮状病毒感染时的处理措施，基本无显著效果。临床解剖主要症状为胃肠道的严重出血。对严重腹泻仔猪采集的样本分析发现，流行性腹泻、传染性胃肠炎和轮状病毒检测阳性率较低，阳性率不足5%，而猪博卡病毒(porcine bocavirus, PBoV)和Kobu病毒检测阳性率达到86. 6%。由此可见，PBoV和Kobu病毒是这次仔猪腹泻的罪魁祸首。但到目前为止，由于对该两种病毒的认识还不够深入，尚无有效的疫苗和防治措施以及商业化的检测试剂盒问世，因此研制PBoV检测试剂盒能对该病进行快速诊断，对临床治疗和疾病控制有巨大的意义。环介导的等温扩增技术(loop-mediatedisothermal amplification,LAMP)是由T. Notomi于2000年专利技术的一种新型核酸扩增技术，该技术依赖四条特异性的引物针对目的序列的四个区域进行扩增，所运用的DNA聚合酶具有链置换功能，因此可以实现恒温扩增。由于其扩增依赖于目的序列的四个特异性区域，因此其特异性和敏感性均较普通PCR和荧光定量PCR高，而且由于该反应在恒温条件下进行，因此不需要昂贵的仪器，而使用普通的水浴锅即能进行扩增反应，另外在扩增反应可以在一个小时之内完成，所需时间短，且其反应产物易于观察，可以通过肉眼判定扩增样本是否为阳性。基于以上优点，LAMP至专利技术之日其，已被广泛用于病原的检测，如病毒性出血败血症、巨细胞病毒、埃博拉病毒、丙型肝炎病毒、疱疹病毒、结核杆菌、沙门氏菌、大肠杆菌、禽流感、猪流感等病毒性疾病和细菌性疾病的检测。到目前为止，未发现运用LAMP方法检测PBoV的报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是，可以高效快速的对可疑PBoV感染进行检测，且检测手段简单，不需要昂贵的实验仪器，适合在临床疾病诊断中推广。本专利技术的目的是通过以下技术方案来实现一种检测猪博卡病毒(PBoV)的LAMP试剂盒，包含用无菌双蒸水配制的LAMP反应试剂，每个反应加入24 μ L LAMP反应试剂，其中LAMP反应液24 μ L包含的组分及浓度分别为:IOU 的 BstDNA 聚合酶，2. 5μ L 的聚合酶缓冲液(200mM Tris-HCl (pH 8. 8), IOOmM KCl，IOOmM (NH4)2SO4,1 % Triton X-100)，150mmol 的 MgSO4, 25mmol 的甜菜碱，30mmol 的 dNTP,5pmol的引物Pl,5pmol的引物P2,40pmol的引物P3,40pmol的引物P4,其中各引物序列分别为PlCCAATCTGGCCAAGAGCAT,P2 CGGCAACAGCATAGAGTCC,P3 CCACACGATCAGCTTGGCCGGCTATACGGCTGCGTGAAC,P4 TGGGAAGAAGCGCTGATGCAC-TCGGTCGATCCTGAACTCG。·一种检测猪博卡病毒(PBoV)的LAMP试剂盒的制备方法，包括以下步骤I)从NCBI数据库Genbank中查找PBoV序列,运用序列比对软件DNAstar进行同源性分析，获得PBoV的保守靶序列；2)根据步骤I)获得的序列运用PrimerExplore V4在线引物设计软件进行引物设计，选取保守序列区作为构建试剂盒所使用引物，引物序列分别为PlCCAATCTGGCCAAGAGCAT,P2 CGGCAACAGCATAGAGTCC,P3 CCACACGATCAGCTTGGCCGGCTATACGGCTGCGTGAAC,P4 TGGGAAGAAGCGCTGATGCAC-TCGGTCGATCCTGAACTCG ；3)将步骤2)所设计的引物进行合成，运用无菌双蒸水配制LAMP反应试剂，其中LAMP反应液24 μ L包含的组分及浓度分别为10U的BstDNA聚合酶，2. 5 μ L的聚合酶缓冲液(200mM Tris-HCKpH 8. 8), IOOmM KCl, IOOmM(NH4)2SO4,1 % Triton X-100)，150mmol 的MgSO4, 25mmol 的甜菜喊，30mmol 的 dNTP,5pmol 的引物 Pl，5pmol 的引物 P2,40pmol 的引物P3，40pmol 的引物 P4。在LAMP反应试剂中加入I μ L待检测模板混匀后，置65°C反应I小时，反应完成后观察反应管中是否出现混浊以判定扩增结果，为方便观察，可在反应后将反应管置离心机内12000转/分离心I分钟，观察管底有无白色沉淀，如果观察到白色沉淀则判为阳性。本专利技术的有益效果为高特异性和高敏感性，运用四条引物，针对PBoV序列的四个保守区域进行扩增，其特异性和敏感性均比同条件下的PCR和定量PCR高；操作简单，易于判定，扩增反应只需要一个恒温水浴锅即可，而且可以在一个小时内完成扩增反应；结果判定简单，可以运用肉眼判定是否出现混浊以判断是否有特异性的扩增，与普通PCR和定量PCR相比较而言，不需要昂贵的仪器设备，而且扩增完成后可以在不开盖的情况下判定结果，避免了扩增产物对后续检测的污染。具体实施例方式PBoV LAMP引物设计与筛选登录NCBI 网站 http://www. ncbi. nlm. nih. gov/,查找 Genbank 公布的 PBoV 的序列，运用DNAstar进彳丁序列比对后，以猪博卡病毒基因组序列HM053694为I旲板，运用PrimerExplore V4在线引物设计软件进行LAMP反应引物设计,从设计的引物序列中选取如下4条引物进行特异性、敏感性的实验并最终确认试剂盒使用的引物组分，PlCCAATCTGGCCAAGAGCAT,P2 CGGCAACAGCATAGAGTCC,P3 CCACACGATCAGCTTGGCCGGCTATACGGCTGCGTGAAC,P4 TGGGAAGAAGCGCTGATGCAC-TCGGTCGATCCTGAACTCG,运用正交实验进行各组分的优化，确立以上所述引物在LAMP试剂盒中使用的比例及其反应浓度每个反应体系中各引物的反应浓度，5pmol的引物Pl，5pmol的引物P2，40pmol的引物P3，40pmol的引物P4。试剂盒的组装(以50个反应为例):本专利技术所述试剂盒仅由LAMP反应液构成，该反应液由灭菌双蒸水配制，其中规格 本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种检测猪博卡病毒(PBoV)的LAMP试剂盒，其特征在于，其包含用无菌双蒸水配制的LAMP反应试剂，每个反应加入24μL？LAMP反应试剂，其中LAMP反应液24μL包含的组分及浓度分别为：10U的BstDNA聚合酶，2.5μL的聚合酶缓冲液，150mmol的MgSO4，25mmol的甜菜碱，30mmol的dNTP，5pmol的引物P1，5pmol的引物P2，40pmol的引物P3，40pmol的引物P4，其中各引物序列分别为：P1：CCAATCTGGCCAAGAGCAT，P2：CGGCAACAGCATAGAGTCC，P3：CCACACGATCAGCTTGGCCGGCTATACGGCTGCGTGAAC，P4：TGGGAAGAAGCGCTGATGCAC？TCGGTCGATCCTGAACTCG。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：李帅伟，付仁一，
申请(专利权)人：广州格拉姆生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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