本发明专利技术提供了一种检测BCL2L11基因多态性的方法，其特征在于，其包括如下实现步骤：设计了两对引物，突变型引物以及野生型引物，一对引物跨越2903bp的缺失区域，当此片段未缺失时，实验条件限制反应，扩增不出如此长的片段；当此片段缺失时，会扩增出一个261bp的片段；另外一对引物在2903bp的缺失区域中，当此片段未缺失，会扩增出一个365bp的片段；此技术在同一个反应体系中同时扩增两条不同的产物，鉴定样本基因型。而且扩增片段长度适中，扩增条件范围宽泛，使用仪器简单。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物技术和医学领域，尤其是分子生物学，聚合酶链式反应。
技术介绍
酪氨酸激酶抑制剂(TKI)是重要的一类抗癌靶向药物，在激酶异常的肿瘤治疗中得到了广泛应用，且效果非常好，比如断裂点簇集区-细胞abl癌基因(BCR-ABL)融合的慢性粒细胞性白血病(CML)、表皮生长因子受体(Epidermal growth factor receptor, EGFR)外显子19/21突变的非小细胞肺癌(NSCLC)。但随着使用人群的不断增加，发现有部分基因突变的患者治疗效果不显著，或者有部分患者开始时效果很好，但随着治疗进行，药物的效果逐渐减弱。其中EGFR外显子20的T790M突变是导致药物耐受的重要的原因，随着研究的不断展开，发现表皮生长因子受体(Epidermal growth factor receptor, EGFR)通路的其他突变也会导致药效，比如kirsten大鼠肉瘤病毒原癌基因(Kirsten rat sarcoma viraloncogene homolog,kras)密码子12、13、61突变、棘皮动物微管样蛋白4-间变性淋巴瘤受体酪氨酸激酶(EML4-ALK)融合等。当然，以上都是癌细胞特异突变，而B-细胞慢性淋巴细胞白血病/淋巴瘤-2样11 (BCL2L11)基因(又名BM)多态性也和TKI药物的耐受相关，并且其属于种系基因突变，通过非创伤性检测就可以进行，可以早期对TKI药物的适用性进行判断，更有效的治疗，节省治疗成本。BM基因是凋亡相关基因，参与TKI诱导的凋亡过程。当BM的受到抑制，表达水平降低时会显著影响TKI的效果。BIM的多态性是指其基因内含子2中会缺失2903bp的DNA序列，导致BM外显子3和4的拼接错误，得到不完整的蛋白质，使BM不能行使功能。不完全统计，在东亚人群中这种多态性达到了 12. 3%，但在非洲和欧洲人群中还未发现此种变化。目前关于BM基因多态性的检测，相关的专利还没有，文献报道也很有限。已有的报道中所采用的检测方法是需要扩增一段4226bp的DNA序列，但是，如此长的序列在实际操作中并不容易实现，失败的几率非常高，不能开发为BIM基因多态性的稳定的检测手段。并且，当只能获得受检者的石蜡包埋组织时，其DNA由于经受过化学试剂的处理，已经断裂为500bp以下的小片段，无法采用此种方法检测。鉴于以上的问题，一种新的、可操作性能更高的快速检测方法的专利技术是势在必行的。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题主要是BIM的多态性是指其基因内含子2中会缺失2903bp的DNA序列，导致BM外显子3和4的拼接错误，得到不完整的蛋白质，使BIM不能行使功能。已有的报道中所采用的检测方法是需要扩增一段4226bp的DNA序列，但是，如此长的序列在实际操作中并不容易实现，失败的几率非常高，不能开发为BIM基因多态性的稳定的检测手段。并且，当只能获得受检者的石蜡包埋组织时，其DNA由于经受过化学试剂的处理，已经断裂为500bp以下的小片段，无法采用此种方法检测。为了解决以上问题，本专利技术技术提供了一种检测BCL2L11基因多态性的方法，其包括如下实现步骤设计了两对引物，突变型引物以及野生型引物，一对引物跨越2903bp的缺失区域，当此片段未缺失时，实验条件限制反应，扩增不出如此长的片段的；当此片段缺失时，会扩增出一个261bp的片段；另外一对引物在2903bp的缺失区域中，当此片段未缺失，会扩增出一个365bp的片段。所述扩增的野生型引物序列为·正向引物wmF CAGAACAGACACTGGAACAAAATGA反向引物wR GGGAGCATTTTCATGAGTACAACAA所述扩增的突变型引物序列为正向引物wmF CAGAACAGACACTGGAACAAAATGA (与野生型 F 相同)反向引物mR GGTGGCCATACAAATCTAAGCCAG所述具体处理步骤如下样本处理，取外周血2ml于EDTA抗凝管中，轻柔地颠倒混匀,4°C保存； DNA提取，取200 μ L抗凝血用试剂盒提取DNA，采用电泳凝胶成像对DNA纯度和浓度作检测；反应体系的配置，在每一个反应空中加入一定的反应体系；按一定的程序进行扩增；电泳检测扩增结果。所述反应体系以下10*PCR缓冲液5 μ L Taq DNA 聚合酶I μ L ( 2 U ) dNTP (2. 5mM)3 μ LwmF (ΙΟμΜ)4 μ L WR(IOpM)2 μ LmR (I ΟμΜ)2 μ Ltemplate2 μ L (>5Ong ) Η20up to 50 μ L total50 μ L所述按以下程序进行扩增95 °C 3min94°C 30sec — (50-60。0 都行 30sec — 72°C 30sec，40 个循环72°C 5min — 4°C所述电泳检测扩增结果步骤如下配2%琼脂糖凝胶，取9 μ L(3)扩增的产物与10倍浓度上样缓冲液混匀后上样，120V电泳30min，紫外判断PCR结果；当片段缺失时，会扩增出一个261bp的片段；当此片段未缺失，会扩增出一个365bp的片段；如果261bp和365bp产物同时存在，此样本为杂合子。本专利技术的有益效果是此技术在同一个反应体系中同时扩增两条不同的产物，鉴定样本基因型。而且扩增片段长度适中，扩增条件范围宽泛，使用仪器简单。附图说明图I为本专利技术三条引物所在位置的示意具体实施例方式本专利技术应用于生物技术和医学领域，尤其是分子生物学，分子诊断，实时定量PCR技术。 如图I所示，本专利技术为了解决以上问题，设计了两对引物，一对引物跨越此2903bp的缺失区域，当此片段未缺失时，实验条件限制反应，扩增不出如此长的片段的；当此片段缺失时，会扩增出一个26Ibp的片段。另外一对引物在此2903bp的区域中，当此片段未缺失，会扩增出一个365bp的片段；扩增野生型引物序列正向引物wmF : CAGAACAGACACTGGAACAAAATGA反向引物wR GGGAGCATTTTCATGAGTACAACAA扩增突变型引物序列正向引物 wmF :CAGAACAGACACTGGAACAAAATGA (与野生型 F 相同) 反向引物mR : GGTGGCCATACAAATCTAAGCCAG具体处理步骤如下(6)样本处理取外周血2ml于EDTA抗凝管中，轻柔地颠倒混匀，4°C保存。(2) DNA 提取取200 μ L抗凝血用Q IAmp DNA Blood Mini Kit试剂盒提取DNA。采用电泳凝胶成像对DNA纯度和浓度作检测；(3)反应体系的配置在每一个反应空中加入以下反应体系(PCR试剂购买自TaKaRa) 10*PCR缓冲液5 μ LTaq DNA 聚合酶I μ L ( 2 U ) dNTP (2. 5mM)3 μ LwmF (I ΟμΜ)4 μ L WR(IOpM)2 μ ηΛ(ΙΟμΜ) μΙtemplate2 μ L (> 5Ong) I丨20up to 50 μ L totalμL(4)按以下程序进行扩增95 °C 3min94°C 30sec — (50-60°C)都行 30sec — 72°C 30sec,40 个循环7本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种检测BCL2L11基因多态性的方法，其特征在于，其包括如下实现步骤：设计了两对引物，突变型引物以及野生型引物，一对引物跨越2903bp的缺失区域，当此片段未缺失时，实验条件限制反应，扩增不出如此长的片段的；当此片段缺失时，会扩增出一个261bp的片段；另外一对引物在2903bp的缺失区域中，当此片段未缺失，会扩增出一个365bp的片段。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：赵新泰，王明，
申请(专利权)人：上海赛安生物医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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