一种肌酸激酶固定化的方法技术

本发明专利技术提出了一种肌酸激酶固定化的方法。它以壳聚糖为原料，先制备出交联壳聚糖溶液，再制备出交联壳聚糖微球，然后制备出接枝赖氨酸交联壳聚糖树脂，最后以接枝赖氨酸交联壳聚糖树脂为载体固定化肌酸激酶。本发明专利技术的优点可以使用常规的生产设备在温和的条件下生产磷酸肌酸，工艺简单，操作简便且易于控制，生产成本低，提高了生产效率，生产过程有利于保护环境；且制备的固定化肌酸激酶对热、酸、碱、有机溶剂等条件的稳定性都有显著增加。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及肌酸激酶固定化制备
，具体涉及一种以接枝赖氨酸交联壳聚糖微球固定化肌酸激酶的方法。
技术介绍
肌酸激酶是一个与细胞内能量运转、肌肉收缩、ATP再生有直接关系的重要激酶，能可逆地催化肌酸与ATP之间的转磷酰基反应。用于心肌梗塞的早期诊断，各种肌肉疾病的测定，以及制备磷酸肌酸等方面。游离肌酸激酶以兔肌肉为原料制备，价格昂贵，在溶液中不稳定，容易变性失活，反应后难以分离回收，无法重复利用。这极大地限制了肌酸激酶的应用，特别是用在以肌酸激酶为催化剂制备磷酸肌酸的反应中。酶的固定化是通过物理或化学方法使游离酶束缚于水不溶介质中的过程，其目的是使被束缚的酶能连续进行反应，反应后便于回收酶并重复使用。与只能使用一次的游离酶相比，固定化酶既保留了游离酶的催化特性，又具有稳定性好、反应过程控制、可组装成酶反应器，进行多酶组合连续反应、可再生并反复使用、成本低等优点，是生物催化剂发展的热门领域。现有的酶的固定化的工艺，例如2011年11月30号公开号为CN102260665A的“一种马来酰化壳聚糖微球固定化脲酶的制备方法”专利，公开的方法是以一定配比的乳化剂、油相溶剂和单体组成油相，以一定配比的脲酶、引发剂和马来酰化壳聚糖溶解到水中组成水相，将水相加入油相，加入交联剂反应，再经洗涤，洗脱而制备出产品。该方法以马来酸酐交联壳聚糖氨基，在制备出马来酰化壳聚糖微球固定化载体的同时将脲酶固定于微球内，该方法的缺点是马来酸酐在与壳聚糖游离氨基反应的同时，也与脲酶的游离氨基反应，还发生脲酶游离氨基间的交联反应，一部分固定化脲酶直接交联于丁二酰骨架上，由于丁二酰基亲水性差，会显著扰动固定化脲酶的构象，明显降低固定化脲酶与底物的亲和力；一部分通过马来酸酐自交联产生的固定化脲酶，由于体积显著增大，导致其''刚性明显增力口，催化活性显著降低；此外，部分壳聚糖游离氨基与马来酸酐交联，形成交联壳聚糖载体，显著减少了参与固定化脲酶的壳聚糖游离氨基，导致固定化荷载小；加之马来酸酐碳链较短、与游离氨基的反应条件较苛刻，因此，以马来酸酐为交联剂制备的脲酶蛋白偶联率低、活力回收低、与底物的亲和力低、催化活力低。
技术实现思路
本专利技术提出，它能够有效地克服现有技术中的不足，可以使用常规的生产设备在温和的条件下生产磷酸肌酸，工艺简单，操作简便且易于控制，生产成本低，提高了生产效率，生产过程有利于保护环境；且制备的固定化肌酸激酶对热、酸、碱、有机溶剂等条件的稳定性都有显著增加。本专利技术的技术方案是这样实现的，它以壳聚糖为原料，先制备出交联壳聚糖溶液，再制备出交联壳聚糖微球，然后制备出接枝赖氨酸交联壳聚糖树脂，最后以接枝赖氨酸交联壳聚糖树脂为载体固定化肌酸激酶。I、制备交联壳聚糖溶液的步骤为(I)以壳聚糖为原料，按壳聚糖的质量体积浓度为I 5%的盐酸溶液的体积比为I :25 50的比例，将壳聚糖溶解于盐酸溶液中，形成壳聚糖溶液；所述壳聚糖的质量按克来计量，盐酸溶液的体积按毫升来计量；( 2 )再在搅拌条件下在(I)步骤中加入等体积的液体石蜡进行分散，制备出液体石蜡分散的壳聚糖溶液；(3)然后按壳聚糖的质量体积浓度为2. 5% 5. 0%的双缩水甘油醚溶液的体积比为I : 10 30的比例，在液体石蜡分散的壳聚糖溶液中加入双缩水甘油醚溶液，进行交联反应20 30分钟，就制备出交联壳聚糖溶液；所述壳聚糖的质量按克来计量，双缩水甘油 醚溶液的体积按晕升来计量。2、制备交联壳聚糖微球的步骤为(I)将第I步中制备出的交联壳聚糖溶液，先按致孔剂碳酸钙壳聚糖的质量比为I :1 3的比例，在交联壳聚糖溶液中加入致孔剂碳酸钙粉末，搅拌混合均匀；(2)再用O. I 1%氢氧化钠溶液调节体系pH为9 10. 5，然后升温至60 70°C，并在60 70°C恒温下反应2. 5 3. 5小时后，将反应物泵入抽滤机中，进行第一次抽滤，分别收集第一次抽滤渣和抽滤液；(3)对于收集的第一次抽滤渣，先用等体积的温度为50 60°C热蒸馏水反复进行洗涤2 4次，除去残留的液体石蜡，分别收集洗涤液和洗涤后的滤渣,对于收集的洗涤液，先与收集的第一次抽滤液合并后，再泵人离心机中，在转速为2000 4000转/分下，进行离心分离，分别收集上层液体石蜡和下层清液，对于收集的上层液体石蜡，可再次用于分散壳聚糖溶液；对于收集的下层清液，经生化处理达标后排放；对于收集的洗涤后的滤渣，先加入3 6倍体积的体积浓度为2 5%的盐酸溶液，在搅拌下溶解洗涤后滤渣中的碳酸钙而形成混合液；然后将该混合液泵入抽滤机中，进行第二次抽滤，分别收集脱碳酸钙滤过液和脱碳酸钙滤渣；(4)将收集的脱碳酸钙滤过液泵人蒸发器中，在80 100°C下，进行蒸发浓缩，回收氯化钙浓缩液，可再利用；对于收集的脱碳酸钙滤渣，先用蒸馏水反复进行洗涤至洗涤液的PH值为6. 5 7. 5为止，分别收集洗涤液和洗涤后的碳酸钙滤渣，洗涤后的碳酸钙滤渣即为制备出的交联壳聚糖微球，对于洗涤液经生化处理达标后排放。3、制备接枝赖氨酸交联壳聚糖树脂的步骤为(I)按第2步制备出的交联壳聚糖微球中的游离氨基二环己基碳化二亚胺赖氨酸游离羧基的摩尔比为1:1 2:1 5的比例，先将第3 (4)步骤制备出的交联壳聚糖微球加入赖氨酸的质量浓度为O. 15 O. 25%的赖氨酸水溶液中，搅拌进行分散后,然后加入二环己基碳化二亚胺，在常温下反应10 50分钟，反应完成后进行抽滤，分别收集滤渣和滤液；(2)对于收集的滤液，含赖氨酸和二环己基碳化二亚胺，可再用于制备接枝壳聚糖赖氨酸树脂；对于收集的滤渣，先用3 7倍的95%的乙醇溶液洗涤，除去二环己基碳化二亚胺衍生物，再进行抽滤，分别收集95%乙醇洗涤溶液和滤渣；(3)对收集的95%乙醇洗涤溶液，进行蒸馏回收乙醇；对收集的滤渣，装入截留分子量为IOOODa 5000Da的透析袋中，对水透析过夜，除去残存的赖氨酸，次日收集透析袋内的球形颗粒，在60 80°C下进行干燥，直至恒重，即制备出交联壳聚糖-赖氨酸树脂。4、制备交联壳聚糖-赖氨酸树脂固定化肌酸激酶的步骤为(I)配制肌酸激酶缓冲溶液将肌酸激酶活性为1000U/g 10000U/g的肌酸激酶产品先用甘氨酸质量浓度为0. 2mol/L的甘氨酸溶液溶解，在溶解时调节温度为4 10°C，用氢氧化钠调节pH为8 10，然后用I. O I. 5微米的微孔滤膜过滤,收集滤过液,就制备出肌酸激酶缓冲溶液，其中肌酸激酶活力为10 50U/mL，现配现用，用于制备固定化肌酸激酶；(2)将第3步制备出的交联壳聚糖-赖氨酸树脂置于反应器中，按照交联壳聚糖-赖氨酸树脂的质量第5 (I)步骤制备出的肌酸激酶缓冲溶液的体积比为1:50 100的比例，加入第5(1)步骤制备的肌酸激酶缓冲溶液，在搅拌下处理30 60分钟；所述交联壳聚糖-赖氨酸树脂的质量按克来计量，肌酸激酶缓冲溶液的体积按毫升来计量；·(3)再按照交联壳聚糖-赖氨酸树脂的质量戊二醛体积分数5% 10%的戊二醛溶液的体积为I :5 10的比例，再加入戊二醛溶液，在室温下搅拌反应0. 5 2小时，反应完成后进行抽滤，分别收集滤渣和滤液；所述交联壳聚糖-赖氨酸树脂的质量按克来计量，戍二醒溶液的体积按晕升来计量；(4)对于收集的滤液，含本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种肌酸激酶固定化的方法，其特征在于：它以壳聚糖为原料，先制备出交联壳聚糖溶液，再制备出交联壳聚糖微球，然后制备出接枝赖氨酸交联壳聚糖树脂，最后以接枝赖氨酸交联壳聚糖树脂为载体固定化肌酸激酶。

【技术特征摘要】
1.一种肌酸激酶固定化的方法，其特征在于它以壳聚糖为原料，先制备出交联壳聚糖溶液，再制备出交联壳聚糖微球，然后制备出接枝赖氨酸交联壳聚糖树脂，最后以接枝赖氨酸交联壳聚糖树脂为载体固定化肌酸激酶。2.根据权利要求I所述的一种肌酸激酶固定化的方法，其特征在于制备交联壳聚糖溶液的步骤为 (O以壳聚糖为原料，按壳聚糖的质量体积浓度为I 5%的盐酸溶液的体积比为I :25 50的比例，将壳聚糖溶解于盐酸溶液中，形成壳聚糖溶液；所述壳聚糖的质量按克来计量，盐酸溶液的体积按毫升来计量； (2)再在搅拌条件下在(I)步骤中加入等体积的液体石蜡进行分散，制备出液体石蜡分散的壳聚糖溶液； (3)然后按壳聚糖的质量体积浓度为2.5% 5. 0%的双缩水甘油醚溶液的体积比为I : 10 30的比例，在液体石蜡分散的壳聚糖溶液中加入双缩水甘油醚溶液，进行交联反应20 30分钟，就制备出交联壳聚糖溶液；所述壳聚糖的质量按克来计量，双缩水甘油醚溶液的体积按晕升来计量。3.根据权利要求I所述的一种肌酸激酶固定化的方法，其特征在于制备交联壳聚糖微球的步骤为 (1)将制备出的交联壳聚糖溶液，先按致孔剂碳酸钙壳聚糖的质量比为I:1 3的比例，在交联壳聚糖溶液中加入致孔剂碳酸钙粉末，搅拌混合均匀； (2)再用O.I 1%的氢氧化钠溶液调节体系pH为9 10. 5，然后升温至60 70°C，并在60 70°C恒温下反应2. 5 3. 5小时后，将反应物泵入抽滤机中，进行第一次抽滤，分别收集第一次抽滤渣和抽滤液； (3)对于收集的抽滤渣，先加入3 6倍体积的体积浓度为2 5%的盐酸溶液，在搅拌下溶解洗涤后滤渣中的碳酸钙而形成混合液；然后将该混合液泵入抽滤机中，进行第二次抽滤，分别收集脱碳酸钙滤过液和脱碳酸钙滤渣； (4)对于收集的脱碳酸钙滤渣，先用蒸馏水反复进行洗涤至洗涤液的pH值为6.5 7. 5为止，分别收集洗涤液和洗涤后的碳酸钙滤渣，洗涤后的碳酸钙滤渣即为制备出的交联壳聚糖微球。4.根据权利要求I所述的一种肌酸激酶固定化的方法，其特征在于制备接枝赖氨酸交联壳聚糖树脂的步骤为 (1)按制备出的交联壳聚糖微球中的游离氨基二环己基碳化二亚胺赖氨酸游离羧基的摩尔...

【专利技术属性】
技术研发人员：毛先兵，周小华，苏昱，陈真文，冉隆富，
申请(专利权)人：西南药业股份有限公司，重庆大学，
类型：发明
国别省市：