梅山猪FUT1基因及其克隆和原核表达制造技术

本发明专利技术公开了一种梅山猪FUT1基因及其克隆和原核表达，该基因的核苷酸序列如SEQ?IDNO?2所示；本发明专利技术通过RT-PCR方法克隆得到梅山猪FUT1基因ORF序列，构建了含FUT1基因重组表达质粒，并将重组原核表达质粒转化至BL21菌株体内进行诱导表达。梅山猪FUT1基因的表达成功，为研究FUT1作为ETEC?F18受体蛋白对菌毛的粘附作用以及FUT1特异性抗体的制备奠定了基础。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种梅山猪FUTl基因的克隆和原核表达方法，属于生物

技术介绍
F18+肠毒素性大肠杆菌是引起仔猪腹泻和水肿病的主要病原，仔猪发病率为30% 40%，对养猪业造成巨大的危 害。F18+大肠杆菌进入猪肠道后，依靠其菌毛黏附在肠上皮细胞表面，与猪小肠黏膜上皮细胞刷状缘F18+受体结合，进而定居繁殖并产生肠毒素，通过渗透作用引发组织胺的释放，导致血管壁损伤，水分大量渗出，从而引起水肿病和腹泻。F18肠毒素大肠杆菌能否致病直接取决于仔猪肠黏膜上皮细胞刷状缘有无与F18黏附素相应的受体(ETEC F18R) ( F18产肠毒素大肠杆菌)。Vogeli等研究表明，α-I-岩藻糖转移酶基因(Futl)是ETEC F18受体蛋白最佳候选基因，位于猪染色体6qll区段，开放阅读框(ORF)的长度为I 098 bp。该基因307位点存在多态性，该处碱基由G突变为A，从而失去一个Hin6 I酶切位点，这个突变也使得苏氨酸代替了丙氨酸，从而改变了蛋白质的构象和功能，导致了猪对ETEC F 18的敏感性差异，其中AA型为抗性基因型，GG和AG型为敏感性基因型。据此可以通过在猪的育种群体中对FUTl基因型的选择，来培育抗E. coli F18 (F18大肠杆菌)腹泻的品系。而晏学明等，施启顺等，包文斌等究了国内外部分猪种FUTl基因M307位点的多态性，均认为群体AA抗性型个体占少数且只出现在外来猪种中。这就充分表明国外猪种的F18大肠杆菌在抗性遗传基础与国内地方猪种存在着明显的差异，适用于国外猪种的通过筛选获得抗性基因型的育种方法并不能同样适合于中国地方猪种。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种梅山猪FUTl基因的克隆和原核表达方法，对梅山猪的FUTl基因进行基因克隆、原核表达，本专利技术获得了 FUTl蛋白为体外菌毛粘附试验以及制备单克隆抗体提供了良好的实验基础。本专利技术的目的是保护一种梅山猪FUTl蛋白，该蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO I所示。本专利技术的另一目的是保护编码上述梅山猪FUTl蛋白的基因，该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO 2所示。上述梅山猪FUTl蛋白基因的原核表达载体同时也是本专利技术的保护范围。梅山猪FUTl蛋白基因的原核表达载体的构建方法，具体包括如下步骤(I)FUTl基因的克隆取猪的新鲜肺脏组织，提取总RNA，用反转录试剂盒反转录获得总cDNA ;以cDNA为模板，以FUTl-EcoRI-Fl和FUTl-SalI-Rl为引物，进行PCR扩增，得扩增产物，所述FUTl-EcoRI-Fl 和 FUTl-SalI-Rl 引物如下FUTl-EcoRI-Fl :5' -ggagaattcatgtgggtccccagcc-3'FUTl-SalI-Rl:5' -ccgtcgactcaaggcccagccaacatc-3'；(2) FUTl基因克隆载体的构建将步骤(I)所获得回收扩增产物和克隆载体pMD-18-T在T4连接酶的作用下，与16°C连接过夜，构建重组质粒pMD-18-T-FUTl，将重组质粒转化至感受态E. coli DH5a菌中，筛选阳性克隆，进行序列分析，筛选出序列定正确的阳性质粒，获得含有FUTl基因的pMD-18-T-FUTl 重组质粒；(3) FUTl蛋白信号肽分析及去信号肽引物设计通过信号肽预测工具预测FUTl蛋白在1-11氨基酸存在信号肽；设计一对引物去除信号肽;上游引物FUTl-EcoRI-F2引入EcoRI酶切位点，下游引物FUTl_SalI_R2引入SalI 酶切位点；上游引物 FUTl-EcoRI_F2 :5' gcacggaattcatgctagtctgtgtt 3';下游引 物 FUTl_SalI_R25' caatgtcgactcaaggcccagccaacat 3';目的片段大小 1059b ;(4) FUTl去信号肽基因的扩增以步骤(2)中所得的重组质粒pMD-18-T-FUTl为模板，以步骤(3)所述FUTl-EcoRI-F2和FUTl_SalI_R2为引物体外扩增出FUTl基因；25μ I反应体系包括模板1μ l,2XTag PCR master mix 12. 5 μ 1，FUTl-EcoRI_F2 I. 5 μ I, FUTl-Sal I-R2 I. 5μ I,dd H2O 8· 5 μ I . PCR 参数为 94°C 5min,然后 94°C 30s, 60°C 30s, 72°C lmin,共 30 个循环，最后72°C延伸lmin。扩增出目的序列，胶回收目的序列；(5) FUTl基因原核表达载体的构建 用限制性内切酶EcoRI及Sal I双酶切回收的目的片段，同时将原核表达载体PGEX-6P-1进行双酶切，再将酶切过的目的片段和载体用T4DNA连接酶16°C连接过夜构建重组质粒PGEX-6P1-FUT1 ;将重组质粒转化至BL21菌株，培养后筛选阳性克隆，提取重组质粒进行PCR和双酶切酶切鉴定，筛选出序列定正确的阳性质粒，获得含有FUTl基因的PGEX-6P-1-FUT1 BL21 菌株。FUTl基因的表达的方法将转化有重组表达质粒PGEX-6P-1-FUT1的BL21菌接种到含IOOmg / L氨苄青霉素的LB液体培养基，37°C培养过夜；次日以I %的接种量接种到5 m L含100 m g / L氨苄青霉素的L B液体培养基，扩大培养3h后，用终浓度为Immol /L的IPTG进行诱导，于37°C在180r / min摇转培养4h ;取菌液离心后用PBS重悬，加入2X SDS上样缓冲溶液，煮沸5min，冰浴5min后离心取上清进行SDS-PAGE分析。本专利技术通过RT-PCR方法克隆得到梅山猪FUTl基因ORF序列，构建了含FUTl基因重组表达质粒，并将重组原核表达质粒转化至BL21菌株体内进行诱导表达。梅山猪FUTl基因的表达成功，为研究FUTl作为ETEC F18受体蛋白对菌毛的粘附作用以及FUTl特异性抗体的制备奠定了基础。附图说明图I为FUTl目的基因的PCR扩增图其中泳道I: Marker 2000 ;泳道 2: FUTl 基因图2-1、2-2为pMD-18-T -FUTl的PCR鉴定及其酶切鉴定图其中图2-1自左向右依次为泳道I: IOOOObp Marker ;泳道2: pMD-18-T -FUTl质粒；泳道3: pMD-18-T -FUTl质粒图2-2自左向右依次为泳道I: Marker 2000 ;泳道2: FUTl基因图3 FUTl去信号肽基因扩增图其中 自左向右依次为泳道I :2000bp Marker ;泳道2 =FUTl去信号肽基因图4-1、4-2为PGEX-6P-1-FUT1质粒的PCR鉴定及酶切鉴定图其中图4-1中自左向右依次为泳道I :2000bp Marker ;泳道2 =FUTl去信号肽图4-2 中自左向右依次为泳道 I: IOOOObp Marker ;泳道 2 :PGEX-6P-1_FUT1图5重组表达质粒在BL21菌中诱导表达鉴定图其中自左向右依次为泳道I :PGEX-6P-1载体诱导4h ;泳道2 :PGEX-6P-1_FUT1重组质粒未诱导；泳道3 PGEX-6P-1-FUT1本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种梅山猪FUT1蛋白，其特征在于，该蛋白的氨基酸序列如SEQ？ID？NO？1所示。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：王桂军，张海运，陈建文，朱英奇，孙裴，徐前明，王蓓，包文斌，叶兰，
申请(专利权)人：安徽农业大学，
类型：发明
国别省市：