一种脱氮副球菌的培养方法及其在养殖水质净化中的应用技术

本发明专利技术涉及一种脱氮副球菌的培养方法及其在养殖水质净化中的应用，属于水产养殖技术领域。其采用对水产养殖生物和脱氮副球菌无害的糖蜜、味精废液等多种低价值材料和生产废弃物为原料，经合理复配成液体培养基并生产高活性高浓度的脱氮副球菌菌液，将菌液直接投入养殖水体，修复养殖水体生态环境，为水产养殖生物营造一个有利于生存和生长的良好水体环境。本发明专利技术使用后见效快且效果稳定，可根据水体溶氧情况选择所需去除的无机氮素形式和去除速率，显著降低水体中氨氮、亚硝酸盐、硝酸盐等有害物质的含量，改善水环境质量和养殖生物生存条件，提高养殖生物的产量和质量。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种脱氮副球菌的培养方法及其在养殖水质净化中的应用，属于水产养殖

技术介绍
近年来，我国的水产养殖业发展迅速，养殖规模不断扩大。人们为了追求高产、高效，往往在养殖水体中投入大量的富含氮素等营养物质的饵料和肥料，导致养殖水体中无机氮(NH4+-N、NCV-N、N(V-N)的过度积累，影响水体生态环境质量。无机氮中的亚硝态氮是致癌物质，能导致细胞及组织癌变，而且可以氧化水生动物体内的亚铁血红蛋白(Fe2+)生成高铁血红蛋白(Fe3+)，使其失去携带氧分子的能力，从而影响水生动物体内氧的运输，使红细胞变性，造成生物死亡；硝态氮过量会使水体中的营养平衡失调，水环境质量降低，并且 在局部厌氧条件下可转化成亚硝态氮。而氨氮在有氧条件下可通过亚硝化和硝化作用生成亚硝态氮和硝态氮。因此对于养殖水体而言，为了保证养殖生物的质量与安全，必须将无机氮素特别是亚硝态氮和硝态氮的含量控制在合理的范围内。水体中硝态氮与亚硝态氮的转化和去除主要是通过微生物的同化吸收和反硝化作用而实现。一般认为反硝化细菌是异养性兼性厌氧细菌，只有在缺氧条件下才以硝酸盐或亚硝酸盐为电子受体，进行反硝化作用。随着研究的深入，好氧反硝化细菌的发现，表明在有氧条件下也可进行反硝化作用。好氧反硝化细菌的发现对养殖水体的环境控制来说是一个福音，因为养殖水体需要充足的溶氧作保证，而在有氧条件下实现脱氮无疑为养殖水体的氮素控制提供了一条良好的途径。近年来，国内外学者开始在好氧反硝化细菌的分离、鉴定、培养和应用等方面进行了一些研究，证实了脱氮副球菌可以在好氧条件下进行反硝化作用。同时脱氮副球菌又是一种兼性化能无机自养细菌，既能在h2、o2、co2同时存在的情况下进行自养生长，也能利用利用各种糖类、氨基酸等有机物进行异养生长，因此，它是在不同条件(好氧或厌氧，自养或异养)下实现氮转化作用的非常好的一种菌株。养殖水体环境的优劣决定了养殖水体的生态环境质量。养殖水体中浓度过高的三氮(氨氮、亚硝态氮、硝态氮)对水产养殖动物及环境危害巨大。目前的养殖水体脱氮改良剂主要分为化学和生物两大类。化学类改良剂作用快速，效果直观，用量较小，但作用对象单一，持续时间短，且往往存在生态不安全性，治标不治本；生物类环境改良剂主要以芽孢杆菌、EM菌等微生物制剂为主，安全有效，但起效时间慢、用量较大，且效果受环境条件影响而不稳定。因此在养殖水环境的氮素污染控制上急需开发一种生产简单、成本低、具有脱氮效果不受水体环境条件影响的新型微生物类环境改良剂，以满足产业发展的需要。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种脱氮副球菌的培养及在养殖水质净化中的应用方法，利用糖蜜、味精废液等作为培养基，经液体深层发酵培养高活性的脱氮副球菌的菌液。菌液直接投入养殖水体，在不同的溶解氧条件下可有针对性地去除或转化氨氮、亚硝态氮或硝态氮，控制水体环境中对养殖生物有害的无机氮素成份，快速修复养殖水体生态环境，为水产养殖生物营造一个良好的水体环境。按照本专利技术提供的技术方案，一种脱氮副球菌的培养方法，培养步骤如下取脱氮副球菌Paracoccus denitrificans, ACCC10489,来自中国农业微生物菌种保藏管理中心；接种到2(Tl00mL灭菌的LB液体培养基中，于28 35°C、8(Tl50 r .mirT1摇床上培养20 30h ；然后将其接入3飞OL经灭菌的LB液体培养基中，于28 35°C、8(Tl50 r · min—1摇床上培养2(T30h，制成菌种种子液备用； 在O. 5^1. O吨不锈钢发酵罐中加入菌种种子液总体积65°/Γ75%的液体发酵培养基，经115 121°C灭菌15 30min后冷却备用；将上述菌种种子液接入发酵罐，在28 35°C、溶氧含量为20% 30%饱和含量的条件下培养24 30h，待菌液浓度> IO9CFU · mL—1时用磷酸调pH值为4飞后放入经灭菌的1 25L桶中备用。所述的LB液体培养基为基础富集培养基，含蛋白胨5 15 8*171，酵母膏3 8 g · L-1, NaCl 5 15 g.L—1，调节 pH 6. 5-7. 5，经 115 121°C灭菌 15 30min 后冷却备用。所述的液体发酵培养基，其组份比例按重量份数计糖分含量> 50%的糖蜜8 15份，味精废液 4 10 份，MgSO4-7H20 O. ΟΓΟ. I 份，K2HPO4 I. (Tl. 5 份，KH2PO4 O. 2 O. 8 份，水78 88份； 于室温下在发酵罐中溶解混合，调节糖蜜和味精废液的比例，使得溶液C/N摩尔比达到10 15 1，并用NaOH或HCl调节溶液pH值至7. 2 7. 5，115 121°C灭菌，冷却后备用。所述味精废液COD 为 10000^100000 mg · Λ TN 为 5000^20000 mg · L'所述菌种种子液的OD6tltl值为O. 8 I. 2，活菌数为I X IO8 9 X IOiciCFU · mL—1。一种脱氮副球菌在养殖水质净化中的应用方法，采用以下步骤将菌浓度为I X IO8 9 X IO10CFU · mL—1脱氮副球菌菌液，按500 1500 mL ·亩·米水深―1的用量于上午9^11时加入到待进化的养殖水体中；根据实际情况，每隔5 10天使用一次。使用效果与无机氮素去除顺序与水体溶氧有关。水体溶氧> 6. Omg · ΙΛ使用后7^8小时开始起作用，氨氮最先开始下降，然后亚硝态氮和硝态氮开始下降。使用后12小时氨氮含量降低70%以上，16小时硝态氮含量降低70%以上,22小时后亚硝态氮含量降低70%以上；3. O mg · Γ1彡水体溶氧彡6.0 mg* Γ1时，使用后1(Γ 2小时开始起作用，硝态氮最先开始下降，然后亚硝态氮和氨氮开始下降。使用后20小时硝态氮含量降低70%以上，40小时后亚硝态氮含量降低70%以上，60小时氨氮含量降低70%以上；0 mg · Γ1彡水体溶氧^3.0 mg* Γ1时，使用后24小时开始起作用，硝态氮和亚硝态氮同时开始下降，然后氨氮降。使用后60小时硝态氮和亚硝态氮含量降低70%以上，120小时后氨氮含量降低70%以上。本专利技术具有如下优点本专利技术采用对水产养殖生物和脱氮副球菌无害的糖蜜、味精废液等多种低价值材料和生产废弃物为原料，经合理复配成液体培养基并采用液体深层发酵的方法生产高活性高浓度的脱氮副球菌菌液，并将菌液直接投入养殖水体，在不同的溶氧条件下有序地选择性地快速降低养殖水环境中的氨氮、亚硝态氮和硝态氮等无机氮素的污染，修复养殖水体生态环境，为水产养殖生物营造一个有利于生存和生长的良好水体环境。本专利技术以味精废液作为液体培养基的主要成分，成本低，使用方便，实现了污水资源化，减少了污染；所生产的脱氮副球菌浓度高，活性强，使用方便，可直接投入养殖水体，使用量小，每亩水面每米水深的用量仅为50(Tl500mL ;使用后见效快且效果稳定，可根据水体溶氧情况选择所需去除的无机氮素形式和去除速率，显著降低水体中氨氮、亚硝酸盐、硝酸盐等有害物质的含量，降低藻类密度，改善水质和底质的环境质量，改善养殖生物生存条件，有效防止养殖生物病害本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种脱氮副球菌的培养方法，其特征是：培养步骤如下：取脱氮副球菌Paracoccus？denitrificans，ACCC10489，来自中国农业微生物菌种保藏管理中心；接种到20~100mL灭菌的LB液体培养基中，于28~35℃、80~150？r·min？1摇床上培养20~30h；然后将其接入3~50L经灭菌的LB液体培养基中，于28~35℃、80~150？r·min？1摇床上培养20~30h，制成菌种种子液备用；在0.5~1.0吨不锈钢发酵罐中加入菌种种子液总体积65%~75%的液体发酵培养基，经115~121℃灭菌15~30min后冷却备用；将上述菌种种子液接入发酵罐，在28~35℃、溶氧含量为20%~30%饱和含量的条件下培养24~30h，待菌液浓度≥109CFU·？mL？1时用磷酸调pH值为4~5后放入经灭菌的1~25L桶中备用。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：吴伟，刘道玉，王琼，瞿建宏，
申请(专利权)人：中国水产科学研究院淡水渔业研究中心，
类型：发明
国别省市：