本发明专利技术涉及产生肌醇六磷酸酶变体的方法，所述肌醇六磷酸酶变体与来源于布氏柠檬酸杆菌的肌醇六磷酸酶具有至少74%同一性并与该肌醇六磷酸酶相比包含至少两个其它的二硫键。这些肌醇六磷酸酶变体具有修饰的，优选改善的性质，如热稳定性、温度概貌、pH概貌、比活性、在动物饲料中的性能、减少的蛋白酶敏感性和/或修饰的糖基化样式。本发明专利技术亦涉及产生的变体，编码这些肌醇六磷酸酶的DNA，其产生方法，及其例如在动物饲料和动物饲料添加剂中的用途。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及产生肌醇六磷酸酶变体的方法，其与来源于布氏柠檬酸杆菌(Citrobacter braakii) ATCC 51113的肌醇六磷酸酶具有至少74%同一性,并与这个及紧密相关的肌醇六磷酸酶相比包含至少一个二硫桥联的建立(即，为其变体)，所述桥联不属于四个天然存在的二硫桥联。本专利技术还涉及编码这些肌醇六磷酸酶的DNA，产生的变体，及其用途，例如在动物饲料和动物饲料添加剂中的用途。布氏柠檬酸杆菌ATCC 51113肌醇六磷酸酶的成熟部分作为SEQ ID NO:2包括在序列表中。专利技术背景
技术介绍
肌醇六磷酸酶是公知的酶，将其添加至动物包括人类的食料中的优点也是公知的。已从多种来源，包括多种真菌和细菌菌株分离出肌醇六磷酸酶。本专利技术的一个目的是提供具有肌醇六磷酸酶活性的替代性多肽(肌醇六磷酸酶)和编码所述多肽的多核苷酸。本专利技术的肌醇六磷酸酶变体与亲本肌醇六磷酸酶相比呈现修饰的或改变的，优选改善的性质。此类性质的非限定性实例为稳定性(如酸稳定性，热稳定性，蒸汽稳定性，造粒稳定性和/或蛋白酶稳定性，特别是胃蛋白酶稳定性)，温度概貌(profile)，pH概貌，比活性，底物特异性，在动物饲料中的性能(如改善的植酸(盐)释放和/或降解)，对糖化作用(glycation)的易感性,和/或糖基化样式。如本文中所述，采用编码肌醇六磷酸酶的亲本多核苷酸的诱变以制备编码相对于由亲本多核苷酸编码的肌醇六磷酸酶具有改善的性质的肌醇六磷酸酶的变体(合成)DNA。已知多种组氨酸磷酸(HAP)类型的肌醇六磷酸酶的三维结构(例如Lim等Nature struct, biol. 7，108-113 (2000))。由此发现，其均具有位于位置对77/108133/407178/187381/390(根据本文中使用的编号)的四个二硫桥联。通常这些桥联占用了分子中存在的所有半胱氨酸。梓棱酸杆菌属(Citrobacter)来自弗氏朽1檬酸杆菌(Citrobacter freundii)的菌株的phyA基因的序列已由Zinin等以登录号AY390262提交至EMBL/GenBank/DDBJ数据库。相应的肌醇六磷酸酶氨基酸序列以登录号Q676V7见于UniProt/TrEMBL数据库。Q676V7预期的成熟部分作为SEQID N0:4包括在本专利技术序列表中。弗氏柠檬酸杆菌Q676V7肌醇六磷酸酶包含如上所示的四个二硫桥联，且不存在其它半胱氨酸。W0-2004/085638 (Republic of National Fisheries Re search andDevelopmentInstitute of Korea)以 SEQ ID NO: 7 公开了来自作为 KCCM 10427 保藏的布氏柠檬酸杆菌YH-15的肌醇六磷酸酶的氨基酸序列。该氨基酸序列的成熟部分作为SEQ IDNO: 3包括在本文中。该序列亦见于数据库Geneseqp,登录号为ADU50737。布氏朽1檬酸杆菌YH-15肌醇六磷酸酶包含如上所示的四个二硫桥联，且不存在其它半胱氨酸。WO 2006/037328 (Novozymes A/S)公开了布氏柠檬酸杆菌 ATCC 51113 的野生型肌醇六磷酸酶(即本文中的SEQ ID NO: 2)以及其变体，该变体亦包括在本专利技术序列表中，即作为SEQ ID NO:6。布氏柠檬酸杆菌ATCC 51113肌醇六磷酸酶包含如上所示的四个二硫桥联，且不存在其它半胱氨酸。WO 2006/038062 和 WO 2006/038128 (Danisco A/S)均公开了以登录号 NCMB41247保藏的弗氏柠檬酸杆菌P3-42的肌醇六磷酸酶基因的氨基酸序列，及其多种变体。该氨基酸序列作为SEQ ID N0:9包括在本文中。这些申请仅公开了一个在位置233用半胱氨酸的取代(S233C)，根据本文中使用的编号，这应为S211C。弗氏柠檬酸杆菌P3-42肌醇六磷酸酶包含如上所示的四个二硫桥联，且不存在其它半胱氨酸。WO 2006/038062和WO2006/038128的文本看起来是相同的。WO 2007/112739 (Novozymes A/S)公开了多种肌醇六磷酸酶变体，其中示例使用布氏柠檬酸杆菌ATCC 51113肌醇六磷酸酶作为亲本。WO 2007/112739表明了二硫桥联的构建等。附图和序列表简述图I是SEQ ID N0:2和9的肌醇六磷酸酶的比对。序列表中序列如下所示权利要求1.一种产生变体肌醇六磷酸酶的方法，所述变体肌醇六磷酸酶与SEQ IDN0:2具有至少74%同一性，并与SEQ ID NO: 2相比包含至少两个二硫桥联的建立，其中所述两个二硫桥联不属于在如SEQ ID NO:2中规定的编号的位置77/108，133/407，178/187和381/390的四个天然存在的二硫桥联。2.权利要求I的方法，其中所述至少两个二硫桥联在选自下组位置对的位置建立A)52/99 ；B)31/177 ；C)46/91 ；D)141/199；E)31/176 ；F)59/100 ;和 G) 162/247。3.权利要求I或2的方法，其中所述第一二硫桥联在位置52和99的残基之间的位置对A建立。4.权利要求1-3的方法，其中所述第二二硫桥联在位置31和177的残基之间的位置B建立。5.权利要求1-4的方法，其中建立的二硫桥联的数量是2，3，4，5，6，和/或7。6.权利要求1-5的方法，其中建立的二硫桥联的数量是2并使用下述位置对的组合 A+B, A+C, A+D, A+E, A+F, A+G, B+C, B+D, B+E, B+F, B+G, C+D, C+E, C+F, C+G, D+E, D+F,D+G, E+F，E+G，和 F+G，其中 A 意指 52/99，B 意指 31/177，C 意指 46/91，D 意指 141/199，E意指 31/176，F 意指 59/100，而 G 意指 162/247。7.权利要求1-5的方法，其中建立的二硫桥联的数量是3并使用下述位置对的组合 A+B+C, A+B+D, A+B+E, A+B+F, A+B+G, A+C+D, A+C+E, A+C+F, A+C+G, A+D+E, A+D+F, A+D+G,A+E+F, A+E+G, A+F+G, B+C+D, B+C+E, B+C+F, B+C+G, B+D+E, B+D+F, B+D+G, B+E+F, B+E+G,B+F+G, C+D+E, C+D+F, C+D+G, C+E+F, C+E+G, C+F+G, D+E+F, D+E+G, D+F+G,和 E+F+G，其中 A 意指 52/99，B 意指 31/177，C 意指 46/91，D 意指 141/199，E 意指 31/176，F 意指 59/100，而 G意指 162/247。8.权利要求1-5的方法，其中建立的二硫桥联的数量是4并使用下述位置对的组合 A+B+C+D, A+B+C+E, A+B+C+F, A+B+C+G, A+B+D+E,A+B+D+F, A+B+D+G, A+B+E+F,A+B+E+G,A+B+F+G, A+C+D+E, A+C+D+F, A本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：LK斯科夫，L德玛利亚，松井知子，
申请(专利权)人：诺维信公司，
类型：
国别省市：
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