包被有前列腺特异性抗原抗体的胶乳颗粒的制备方法及PSA胶乳增强免疫比浊法检测试剂盒技术

本发明专利技术涉及包被有前列腺特异性抗原抗体的胶乳颗粒的制备方法及PSA胶乳增强免疫比浊法试剂盒。本发明专利技术通过优化的物理吸附方法将PSA抗体结合至胶乳颗粒后而获得包被有PSA抗体的胶乳颗粒。本发明专利技术的试剂盒利用结合至胶乳颗粒表面的PSA抗体与人类血液样本中的PSA发生免疫反应形成浊度，通过浊度的上升程度来检测前列腺特异性抗原含量。

【技术实现步骤摘要】
本专利技术提供了一种包被有前列腺特异性抗原(PSA)抗体的胶乳颗粒的制备方法，以及一种利用免疫比浊方法测定人血液样本中PSA含量的试剂盒。本专利技术的制备方法以及检测试剂盒属于临床医学体外诊断领域。
技术介绍
前列腺特异性抗原(Prostate specific antigen, PSA)是由前列腺上皮细胞合成分泌至精液中，是精浆的主要成分之一。在上个世纪60年代末，在研究免疫避孕过程中Hare等人发现，在前列腺液及精液中含有一种分子量大约34000的精液特异性蛋白质。1979年从前列腺组织中提取并纯化了这种蛋白质。由于这种蛋白质只在前列腺组织中存 在，被命名为前列腺特异性抗原。PSA在血清中主要有两种存在形式一种是游离型的PSA(f-PSA)，约占血清PSA总浓度的10%_30%。另一种是与α I-抗糜蛋白酶(ACT)结合的PSA (PSA-ACT)和与α 2_巨球蛋白(AMG)结合的PSA (PSA-AMG),约占血清PSA总浓度的70%_90%。在前列腺癌患者的血清中，t-PSA和f-PSA均有升高。PSA具有靶器官特异性，前列腺癌患者血清中PSA浓度明显升高，所以血清PSA的测定被目前公认为诊断前列腺癌的首选标志物。早期敏感性在40-75%之间，中后期可达75-95%，因此它对前列腺癌的诊断和病程监测具有一定的临床价值。对于PSA的定量检测分析，目前包括酶联免疫吸附分析(ELISA)、放射免疫分析(RIA)和化学发光免疫分析(CLIA)。ELISA操作过程复杂，自动化程度低，检测范围窄，影响因素较多，易造成假阴性和假阳性等缺点也不能满足临床的要求。RIA必须用125I等放射性元素标记，检测设备复杂，必须用专门的仪器测定，其放射性核素的半衰期短，不能长期保存，测定结果不稳定，同时也给实验操作人员带来了放射性伤害。CLIA虽然提高了检测的敏感度和自动化程度，但通常需要昂贵的全自动化学发光测量仪，存在检测时间长和检测成本闻的缺点。胶乳增强透射免疫比浊检测(PETIA)技术是在胶乳凝集定性试验基础上发展建立的一种非放射性均相免疫测定法，可以对各种微量的抗原物质和小分子半抗原进行精确的定量测定，目前越来越多的应用到临床实验室中。与CLIA技术相比，PETIA有效的提高检测速度和降低检测成本。然而，PSA的定量检测分析需要较高的灵敏度，一般的PETIA技术很难达到同CLIA技术相同的灵敏度，需要对PETIA技术的优化改进来达到提高检测PSA灵敏度的目的。在胶乳增强免疫比浊试剂中，将抗原或抗体与胶乳相结合是制备试剂中最重要的步骤，通常有物理吸附法和化学交联法。化学交联法是通过抗原或抗体与胶乳表面的化学基团反应，将抗原或抗体交联在胶乳上。由于化学交联法的反应条件较为强烈且反应时间较长，抗原或抗体的活性损失较大。所以，物理吸附法是一种反应更温和、快速的方法。物理吸附法是靠蛋白质分子结构上的疏水基团与胶乳表面的疏水基团间的相互作用，将抗原或抗体吸附到胶乳表面，由于这是一种弱作用力，蛋白质很容易从颗粒表面解吸下来，导致灵敏度下降且试剂稳定性差。吸附上的抗原(或抗体)量越多、越不易脱落，则灵敏度越高、稳定性越好。由于这种吸附力也会导致一些杂质也吸附到胶乳颗粒上，进一步影响了抗原(或抗体)对颗粒的结合。因此，仍然需要改善包被有抗原(或抗体)的胶乳颗粒的制备方法。
技术实现思路
根据本专利技术的一方面，涉及一种包被有前列腺特异性抗原(PSA)抗体的胶乳颗粒的制备方法，其特征在于，包括步骤I)将胶乳颗粒溶于MES缓冲液中；2)将PSA抗体溶于MES缓冲液中；·3)将步骤2)获得的混合物立即加入到步骤I)获得的混合物中进行反应；4)向步骤3)的反应体系中加入甘氨酸缓冲液终止反应；5)离心去掉上清；6)获得包被有PSA抗体的胶乳颗粒。在本专利技术的优选实施方式中，步骤I)中的MES缓冲液还含有甘油。在本专利技术的一些实施方式中，步骤I)中的MES缓冲液还含有含量为O. 01%至O. 5%的甘油。在一个具体的实施方式中，含有O. 15%的甘油。在本专利技术的一个具体的实施方式中，步骤I)和步骤2)中所述的MES缓冲液为O. 05M MES 缓冲液 pH6。在本专利技术的一些实施方式中，步骤3)所述的反应为在25_40°C下进行1_3小时。在本专利技术的一个具体的实施方式中，步骤3)所述的反应是在37°C下进行2小时。在本专利技术的一个具体的实施方式中，步骤4)所述的甘氨酸缓冲液为O. IM的甘氨酸缓冲液PH7。在本专利技术的一些实施方式中，步骤4)所述的终止反应进行O. 5-2小时。终止反应的反应时间可以由技术人员来确定，可以搅拌或不搅拌，优选在搅拌条件下进行，以保证混合均匀，搅拌速度可以由技术人员根据本领域常规选择来确定。因此，在本专利技术的一个具体的实施方式中，步骤4)所述的终止反应在搅拌条件下进行I小时。在本专利技术的一些实施方式中，所述胶乳颗粒是聚苯乙烯胶乳颗粒。优选地，所述聚苯乙烯胶乳颗粒表面修饰有选自如下化学基团中的一种硫酸基、磺酸基、羧基、氨基、羟基、酰肼基、氯甲基。在本专利技术的一个具体的实施方式中，所述胶乳颗粒是磺酸基修饰的聚苯乙烯胶乳颗粒。优选地，聚苯乙烯胶乳颗粒直径范围为50-250nm。在本专利技术的一些实施方式中，所述PSA抗体为PSA多克隆抗体或PSA单克隆抗体，优选地，所述PSA抗体为PSA单克隆抗体。优选地，所述PSA单克隆抗体可以通过常见文献报道的方法，包括但不限于杂交瘤技术，而获得；或者也可以购买商品化的产品，例如Hytest、Fitzgerald等。在本专利技术的一个具体的实施方式中，所述PSA单克隆抗体是通过杂交瘤细胞技术制备的。在本专利技术的一些实施方式中，在步骤5)和步骤6)之间还可以包括用甘氨酸缓冲液洗涤胶乳颗粒的步骤。优选地，所述甘氨酸缓冲液为含有O. 9%氯化钠、50mM EDTA,O. 5%BSA、0. 5%吐温20、0. 09%叠氮化钠的IOOmM甘氨酸缓冲液pH7。根据本专利技术的另一方面，本专利技术还提供一种用于测定人血液样本PSA含量的胶乳增强免疫比浊法试剂盒，其特征在于，包括Rl试剂和R2试剂；所述Rl试剂包括缓冲液、稳定剂、促凝剂和防腐剂；所述R2试剂包括根据上述制备方法而获得的包被有PSA抗体的胶乳颗粒、缓冲液、稳定剂和防腐剂。在本专利技术的优选实施方式中，试剂盒还可以包括校准品。优选地，校准品由PSAJ^冲液、稳定剂和防腐剂组成。在本专利技术的一些实施方式中，胶乳颗粒是聚苯乙烯胶乳颗粒。优选地，所述聚苯乙烯胶乳颗粒表面修饰有选自如下化学基团中的一种硫酸基、磺酸基、羧基、氨基、羟基、酰肼基、氯甲基。在本专利技术的一些实施方式中，胶乳颗粒直径范围为50_250nm，浓度为O. 05-0. 5%。在本专利技术的一个具体实施方式中，胶乳颗粒直径为lOOnm，最终R2试剂中PSA单克隆抗体包·被的聚苯乙烯胶乳颗粒浓度为O. 25%。在本专利技术的一些实施方式中，所述PSA抗体为PSA多克隆抗体或PSA单克隆抗体。在本专利技术的一个优选的实施方式中，所述PSA抗体为PSA单克隆抗体。优选地，所述PSA单克隆抗体可以通过常见文献报道的方法而获得；或者也可以购买商品化的产品，例如Hytest、Fitzgerald等。在本专利技术的一个具体的实施方式中,所述PSA单克隆抗体本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种包被有前列腺特异性抗原抗体的胶乳颗粒的制备方法，其特征在于，包括步骤：1）将胶乳颗粒溶于MES缓冲液中；2）将前列腺特异性抗原抗体溶于MES缓冲液中；3）将步骤2）获得的混合物立即加入到步骤1）获得的混合物中进行反应；4）向步骤3）的反应体系中加入甘氨酸缓冲液终止反应；5）离心去掉上清；6）获得包被有前列腺特异性抗原抗体的胶乳颗粒。

【技术特征摘要】
1.一种包被有前列腺特异性抗原抗体的胶乳颗粒的制备方法，其特征在于，包括步骤 1)将胶乳颗粒溶于MES缓冲液中； 2)将前列腺特异性抗原抗体溶于MES缓冲液中； 3)将步骤2)获得的混合物立即加入到步骤I)获得的混合物中进行反应； 4)向步骤3)的反应体系中加入甘氨酸缓冲液终止反应； 5)离心去掉上清； 6)获得包被有前列腺特异性抗原抗体的胶乳颗粒。2.根据权利要求I所述的包被有前列腺特异性抗原抗体的胶乳颗粒的制备方法，其中步骤I)中所述的MES缓冲液还含有甘油。3.根据权利要求2所述的包被有前列腺特异性抗原抗体的胶乳颗粒的制备方法，其中甘油含量为O. 01%至O. 5%。4.根据权利要求3所述的包被有前列腺特异性抗原抗体的胶乳颗粒的制备方法，其中甘油含量为O. 15%。5.根据权利要求I所述的包被有前列腺特异性抗原抗体的胶乳颗粒的制备方法，其中步骤I)和步骤2)中所述的MES缓冲液为O. 05MMES缓冲液pH6。6.根据权利要求I所述的包被有前列腺特异性抗原抗体的胶乳颗粒的制备方法，其中步骤3)所述的反应为在25-40°C下进行1-3小时。7.根据权利要求6所述的包被有前列腺特异性抗原抗体的胶乳颗粒的制备方法，其中步骤3)所述的反应为在37°C进行2小时。8.根据权利要求I所述的包被有前列腺特异性抗原抗体的胶乳颗粒的制备方法，其中步骤4)所述的甘氨酸缓冲液为O. IM甘氨酸缓冲液pH7。9.根据权利要求I所述的包被有前列腺特异性抗原抗体的胶乳颗粒的制备方法，其中步骤4)所述的终止反应进行O. 5-2小时。10.根据权利要求9所述的包被有前列腺特异性抗原抗体的胶乳颗粒的制备方法，其中步骤4)所述的终止反应在搅拌条件下进行I小时。11.根据权利要求I所述的包被有前列腺特异性抗原抗体的胶乳颗粒的制备方法，其中所述胶乳颗粒是聚苯乙烯胶乳颗粒。12.根据权利要求11所述的包被有前列腺特异性抗原抗体的胶乳颗粒的制备方法，其中所述聚苯乙烯胶乳颗粒表面修饰有选自如下化学基团中的一种硫酸基、磺酸基、羧基、氨基、羟基、酰肼基和氯甲基。13.根据权利要求11所述的包被有前列腺特异性抗原抗体的胶乳颗粒的制备方法，其中所述聚苯乙烯胶乳颗粒直径范围为50-250nm。14.根据权利要求I所述的包被有前列腺特异性抗原抗体的胶乳颗粒的制备方法，其中所述前列腺特异性抗原抗体为前列腺特异性抗原多克隆抗体或前列腺特异性抗原单克隆抗体。15.根据权利要求14所述的包被有前列腺特异性抗原抗体的胶乳颗粒的制备方法，其中所述前列腺特异性抗原抗体为前列腺特异性抗原单克隆抗体。16.根据权利要求I所述的包被有前列腺特异性抗原抗体的胶乳颗粒的制备方法，其中在步骤5)和步骤6)之间还包括用甘氨酸缓冲液洗涤胶乳颗粒的步骤。17.根据权利要求16所述的包被有前列腺特异性抗原抗体的胶乳颗粒的制备方法，其中所述甘氨酸缓冲液为含有氯化钠、EDTA, BSA、吐温和叠氮化钠的IOOmM甘氨酸缓冲液pH7。18.根据权利要求17所述的包被有前列腺特异性抗原抗体的胶乳颗粒的制备方法，其中所述甘氨酸缓冲液为含有O. 9%氯化钠、50mM EDTA、0. 5%BSA、0. 5%吐温20和O. 09%叠氮化钠的IOOmM甘氨酸缓冲液pH7。19.一种测定人血液样本前列腺特异性抗原含量的胶乳增强免疫比浊法试剂盒，其特征在于，包括Rl试剂和R2试剂； 所述Rl试剂包括缓冲液、稳定剂、促凝剂和防腐剂； 所述R2试剂包括根据权利要求I至18任一项所述的制备方法而获得的包被有前列腺特异性抗原抗体的胶乳颗粒...

【专利技术属性】
技术研发人员：高爱民，孙国敬，张小锐，徐丽，刘希，
申请(专利权)人：北京九强生物技术股份有限公司，
类型：发明
国别省市：