测定糖化蛋白质的组合物制造技术

本发明专利技术提供用于精确测定糖化蛋白质的组合物，该组合物可：1)消除球蛋白和抗坏血酸组分的影响；2)使蛋白酶和能够至少与糖化氨基酸反应的酶保持稳定；3)精确测定清蛋白；和4)测定糖化清蛋白并同时消除糖化血红蛋白的影响，本发明专利技术还提供了测定方法。因此，能够更精确地确定糖化蛋白质和糖化清蛋白的含量。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种用于测定糖化蛋白质的组合物和一种测定糖化蛋白质的方法。可将本专利技术用于测定糖化蛋白质的组合物和方法应用于临床检查，其能够精确地测定糖化蛋白质。
技术介绍
在糖尿病的诊断和控制中测定糖化蛋白质是非常重要的。对能够反应过去约I至2个月的平均血糖值的糖化血红蛋白(GHb)，能反应过去约2周的平均血糖值的糖化清蛋白(GA)，一般地指示血清中具有还原能力的糖化蛋白的果糖胺(FRA)等可每天进行测定。 GHb是血红蛋白的糖化产物，即在血红蛋白链上N-末端缬氨酸的α-氨基基团被糖化。GA和FRA分别是清蛋白和血清蛋白的糖化产物，即清蛋白或血清蛋白的赖氨酸残基上的ε-氨基基团被糖化。酶学方法是一种简易且便宜的精确测定糖化蛋白质的方法。日本专利申请公开 No. 6-46846，No. 5-192193，No. 2-195900 和 No. 2-195899，以及国际专利申请公布号W098/48043和W097/13872是公开此酶学方法的文献实例。然而，为提供一种精确测定糖化蛋白质的组合物，有必要I)消除球蛋白组分和抗坏血酸的影响以及2)使蛋白酶和能够至少与糖化氨基酸反应的酶保持稳定。此外，如果糖化蛋白是糖化清蛋白，则3)精确测定清蛋白和4)消除糖化血红蛋白的影响也很重要。I)消除球蛋白组分和抗坏血酸的影响的常规方法已知糖尿病患者的球蛋白的量能够改变和影响FRA的值。本专利技术人研发了一种方法，其中通过向蛋白酶反应液中加入特定金属离子和蛋白质A或G可选择性地抑制蛋白酶对球蛋白组分的作用(日本专利申请No. 11-231259)。利用此专利技术的方法，可以测定糖化蛋白而不会受到球蛋白组分的影响。应用于此方法中的球蛋白选择性蛋白酶抑制剂可提及的有金属、蛋白A和蛋白G。在此专利申请所述的金属中，强效金属是那些可能会导致环境安全问题的重金属。而弱效金属如果与其它试剂(或组合物)结合可能导致试剂溶液浑浊。另外，蛋白A和蛋白G都是非常昂贵的试剂。作为选择性吸附血液中球蛋白的方法，已知血液处理剂利用色谱学原理以及具有类固醇骨架的引入了配体的乙烯共聚物可对血液中的内毒素和球蛋白进行吸附(日本专利申请公开No. 61-94663)。然而，在日本专利申请公开No. 61-94663的实施例中附表I所示的结果表明只有α I-球蛋白和α 2-球蛋白被证明可被吸附，而占球蛋白组分70%或更多的Y-球蛋白不能被吸附。假设Y-球蛋白被吸附，则不会期望血液处理试剂具有抑制蛋白酶对Y-球蛋白的作用的能力。近年来，大量抗坏血酸作为增补物被摄取的情况越来越多。含有高浓度抗坏血酸的临床样品也在增加。抗坏血酸由于具有强还原性而对临床检查造成多种影响。作为消除抗坏血酸影响的方法，已知可通过化学或利用抗坏血酸氧化酶的酶学方法去除样品中的抗坏血酸。从对显色系统引起较小影响来考虑，当利用至少与糖化氨基酸反应的酶对利用蛋白酶断裂糖化蛋白质所产生的糖化氨基酸进行检测时，优选预先地在与蛋白酶反应时利用抗坏血酸氧化酶(ASOx)去除抗坏血酸的方法。作为蛋白酶存在时利用ASOx去除样品中抗坏血酸的实例，对在pH8.0的2--乙磺酸(HEPES)缓冲液中使ASOx与样品溶液反应的实验已有报道(Clinical Chemistry (临床化学),21 :99-106,1998)。文献报道经过两周的冷藏后处理抗坏血酸的能力没有变化。然而，本专利技术人的研究表明当HEPES缓冲液(pH8. O)、蛋白酶和ASOx存在时，在 370C下贮藏一天或在10°C下贮藏两周后抗坏血酸处理能力已经几乎完全丧失。2)用于稳定蛋白酶和至少与糖化氨基酸反应的酶的现有技术用于糖化蛋白质的临床检测的蛋白酶溶液具有在其它领域如食品业中无法见到的极高浓度。已知蛋白酶在水溶液中能进行自消化。难以想象蛋白酶能以如此高浓度在水溶液中保持稳定。因此，在用于鉴定糖化蛋白的组合物中使用的蛋白酶以冻干产物形式提供。目前尚没有用于测定糖化蛋白质的组合物及测定糖化蛋白质的方法能使其中的蛋白酶以液态形式保持稳定并可长期贮藏。目前也没有测定糖化蛋白质的组合物以及测定糖化蛋白质的方法能使其中的至少与糖化氨基酸反应的酶以液态形式保持稳定并可长期贮藏。3)有关精确测定清蛋白的方法的现有技术抗清蛋白抗体免疫和利用溴甲酚绿(BCG)、溴甲酚紫(BCP)的染色法等是测定清蛋白的方法。染色法由于操作简便成本低廉而被广泛用于每日检测中。虽然已经证实BCG对球蛋白组分的作用，但BCG的缺点是对清蛋白的专一性低。另一方面，BCP尽管对清蛋白具有高专一性但易受到共存物质的影响。尤其是，BCP受到SH化合物的影响，从而导致测定结果依据清蛋白的氧化还原状态出现差异的问题。为解决这一问题，提出了在蛋白质变性剂和/或SH试剂存在时反应BCP的方法(日本专利申请公开No. 10-232233)。然而，还没有关于BCP对GA和非糖化清蛋白(NGA)的反应性的研究实例。4)消除糖化血红蛋白影响的现有技术如上所述，GA是从清蛋白经ε -氨基的糖化衍生得到，而GHb是经糖化血红蛋白β_链上的N-末端缬氨酸的α-氨基得到。因此，如果GA作为测量对象，可能期望只测定 氨基被糖化的氨基酸。虽然已知有几种酶显示出对ε-氨基的高度专一性而且对糖化缬氨酸没有作用(日本专利申请公开No. 11-243950)，但是没有一种酶的成本足够低廉以致可作为实际应用中的酶。其中，来自尖镰孢(Fusarium oxysporm)的果糖基氨基酸氧化酶(FOD)具有高反应性，是有用的。本专利技术人单独报道了 FOD的基因(日本专利申请公开No. 10-201473)。虽然利用此基因的方法产率高且能够以低成本生产F0D，但本专利技术人证实，其与α-氨基被糖化的糖化缬氨酸的反应性没有显示出令人满意的专一性。专利技术详述本专利技术的目的是为精确测定糖化蛋白质提供一种组合物，该组合物I)能够消除球蛋白组分和抗坏血酸的影响以及2)使蛋白酶和至少与糖化氨基酸反应的酶保持稳定，并提供一种稳定方法。本专利技术的另一目的是在糖化蛋白质是糖化清蛋白的情况下提供一种3)能够精确测定清蛋白并且4)能够消除糖化血红蛋白的影响的组合物，及提供一种消除糖化血红蛋白的影响的方法。为精确测定糖化蛋白质，有必要I)消除球蛋白组分和抗坏血酸的影响以及2)使蛋白酶和至少与糖化氨基酸反应的酶保持稳定。此外，如果糖化蛋白是糖化清蛋白，则有必要3)准确测定清蛋白和4)消除糖化血红蛋白的影响。I)消除球蛋白组分和抗坏血酸的影响的方法本专利技术人经过广泛研究发现如果将选自脱氧胆酸，脱氧胆酰胺，胆酰胺，季铵盐，季铵盐类阳离子表面活性剂，伴刀豆凝集素A，辛基葡糖苷，和甜菜碱的一种或多种组分添加到蛋白酶反应溶液中，则可以选择性地抑制蛋白酶对球蛋白组分的作用，而且即使使至少与糖化氨基酸反应的酶直接与此反应溶液反应，也不会抑制此酶促作用而能简单且重复·性极好地精确测定糖化蛋白。这些化合物具有经济方面的优点，与利用常规技术的方法相比没有环境和安全的问题，且与样品混合时不会产生混浊。ASOx能有效除去抗坏血酸。然而，通常很难假定ASOx在含有大量蛋白酶的反应液中能保持稳定。实际上，根据本专利技术人对各种蛋白酶、蛋白酶抑制剂和各种ASOx的研究，尚未发现存在能使ASOx在含本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于测定糖化蛋白质的组合物，其包含蛋白酶和至少与糖化氨基酸反应的酶，其中所述组合物包含含有至少与糖化氨基酸反应的酶的第一试剂和含有蛋白酶的第二试剂。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：高妻卓司，芳陵一生，荒井基夫，炭谷顺一，今村茂行，
申请(专利权)人：旭化成制药株式会社，
类型：发明
国别省市：