本发明专利技术属于家畜分子标记制备技术领域。具体涉及一种与奶牛氧化应激相关性状检测的分子标记及应用。从牛NOS1基因中克隆得到一特异片段，其核苷酸序列如序列表SEQ?ID?NO：1所示，其中在序列表SEQ?ID?NO：1的第121bp处有1个A121-G121的碱基突变，导致HaeⅢ-RFLP多态性；在序列表SEQ?ID?NO：1第149bp处有一个C149-T149的碱基突变，导致Alu?Ⅰ-RFLP多态性。本发明专利技术为奶牛分子标记辅助选择提供了一种新标记。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于家畜分子标记制备
具体涉及一种与奶牛氧化应激相关性状检测的分子标记的制备及应用。
技术介绍
我国的奶牛业历史悠久，但规模化生产起步较晚，相对于发达国家来说，还是存在一定的差距。牛奶对提高国民身体素质的重要性是毋庸质疑的，由于饮食习惯的差异，牛奶被大众普遍接受经历了一个漫长的过程。在我国，居民的人均拥有牛奶是25kg/年，只相当于世界平均水平的1/13，同时奶牛业发展呈现南北不平衡，由于气候，饲料资源等一系列原因，北方占绝对优势。奶牛是喜寒怕热的动物，在我国的南方，每年的7-9月份的高温天气， 会使奶牛产生热应激，往往造成产奶量的大幅下降和疾病的增加，使经济蒙受损失，这是一个不能避免的因素。弹丸之国以色列，位于亚洲西部，是亚、非、欧三大洲结合处，气候炎热干旱，缺乏水源和饲料资源，饲养奶牛条件比较差，但是他们结合本国的情况，依靠自主创新、科技投入和奶业协会的有效协调，使以色列成为世界著名的奶业强国，除了先进的生产管理，另一个重要因素是加强了抗热应激奶牛品种的选育。一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS)催化左旋精氨酸(L-Arg)和分子氧产生的一氧化氮(notric oxide, NO)是炎症反应和氧化应激中重要的相关气使分子之一。NO的生理效应有两面性，一方面可通过使cGMP升高激活蛋白激酶，发挥血管扩张作用，抑制血小板聚集与粘附；通过与谷氨酸琉基结合下调谷氨酸受体调控的离子通道，防止细胞内钙超载，防止NO+向N0_转变，起到细胞保护作用。另一方面NO在高浓度状态下，又可与超氧阴离子(Superoxide anion radical,O2-)反应，生成超氧亚硝酸根离子(peroxyntrite,0N00_)，也可引起细胞核酸亚硝酰化，破坏DNA结构及形成亚硝酞铁络合物，抑制细胞呼吸DNA复制相关的酶活性，发挥细胞毒性作用。(司良毅，1999)NOS作为NO合成的关键酶，在NO的生成调节中起关键作用。迄今有多研究证实三种基因编码不同，但结构相似的一氧化氮亚型诱导型N0S(inducibleN0S，iNOS)、神经型NOS (neuronal NOS, nNOS)和内皮型 NOS endothelial N0S，eNOS)，(陈丹，2008)通过研究肢体缺血再灌注大鼠脑组织中iNOS、nNOS、eNOS的mRNA的表达，通过检测脑组织中的MDA含量和SOD的活性，发现实验组与对照组相比，在缺血再灌注4h组，MDA的含量达到最高，SOD的活力下降到最低。与对照组差异显著(P < 0. 05)，iNOS、nNOS、eNOS的表达量与SOD的活力呈负相关，相关系数分别为(r = -O. 340，-O. 415，-O. 310)，说明NOS的三种基因的超表达会对缺血再灌注后的脑组织构成氧化损伤。
技术实现思路
本专利技术的目的在于扩增奶牛NOSl基因的部分DNA序列，以寻找该基因突变位点多态性，筛选一种与奶牛氧化应激相关性状检测的分子标记。本专利技术还包括该分子标记在奶牛标记辅助选择上的应用。本专利技术通过以下技术方案实现一种筛选奶牛氧化应激相关基因NOSl分子标记，按照以下步骤从Ensembl数据库(http://www.ensembl.org)中获得基因登录号为ENSBTAG00000002023的牛NOSl基因DNA序列，以该基因的DNA序列设计引物；从牛血液基因组中提取总DNA，PCR扩增，PCR产物纯化，获得如SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列，通过PCR-RFLP进行基因型检测和分型，在该序列表SEQ ID NO 1中的第121bp处有一个A121-G121的碱基突变，导致Hae III -RFLP多态性；以及，在该序列的第149bp处有一个C149-T149的碱基突变，导致Alu I -RFLP多态性。此处的第121bp处的碱基相当于牛NOSl基因DNA序列全序列的371bp处，第149bp处相当于牛NOSl基因DNA序列全序列的399bp处(在图3，4，5，6中所示的序列中碱基对应的位置是按照牛NOSl基因DNA序列全序列统 计的，而图2和序列表SEQ ID NO 1是牛NOSl基因的片段及部分DNA序列)。更详细技术细节如《具体实施方式》所述。附图说明序列表SEQ ID NO 1是本专利技术制备的分子标记的核苷酸序列(牛NOSl基因的部分DNA序列)，序列长度为300bp，在序列表SEQ ID NO 1的第121bp处有一个A121-G121的碱基突变，导致Hae III -RFLP多态性；同时在该序列的第149bp处有一个C149-T149的碱基突变，导致Alu I -RFLP多态性。图I :是本专利技术的技术流程图。图2 :是本专利技术扩增的NOSl基因的部分DNA片段(其对应于上述序列表SEQ IDNO 1所示的序列，序列中的英文字母“R”，分别代表突变位置，括号内显示碱基替换)。图3 :是用于PCR直接测序的PCR产物琼脂糖凝胶电泳图。琼脂糖浓度为I. 5%。其中1-5泳道为PCR产物，长度为345bp，M泳道DNA分子量标记(IOObp DNA ladder)。图4，图5 :是371bp处和399bp处PCR测序的彩峰图(此处的371bp处和399bp是NOSl基因的全序列中所处的位置，其中该371bp就是本专利技术扩增的如SEQ ID NO :1序列所示的121bp，399bp就是本专利技术扩增的如SEQ ID NO 1序列所示的149bp)。图6 :是奶牛NOSl基因序列A121-G121和C149-T149的多态性检测结果。具体实施例方式实施例I :牛NOSl基因部分DNA序列的扩增及其多态性检测I、奶牛NOSl基因部分DNA序列的扩增I. I引物设计根据Ensembl提供的牛NOSl基因(基因登录号ENSBTAG00000002023)的序列设计引物对，该引物对的核苷酸序列如下正向引物5’ -CACCACCAGCGTCTGCTCT-3 ’，反向引物5 ’ -GCCGCGGAGCAAAGCGGCCTCATCC-3，。I. 2奶牛血液基因组DNA的提取与检测(I)分离白细胞(2)在含有白细胞的试管中加入Iml的I XSET，加入200ul蛋白酶K(10mg/ml)，10%十二烷基硫酸钠(SDS) lOOul。置入恒温水浴锅55°C消化过夜。(3)加入等体积的平衡酚，(pH = 8. O)，缓慢颠倒离心管lOmin，以使管内溶液混勻，4°C 8000rmp,离心 IOmin0(4)小心吸取上层含有DNA的上清液，移至另一离心管，再加入苯酚重复步骤(3)(5)同法，吸上清，加入等体积的平衡酚/氯仿/异戊醇(体积比为25 24 I),缓慢颠倒离心管lOmin,4°C 8000rmp离心lOmin。(6)吸上清后加入氯仿/异戊醇(体积比24 : I),缓慢颠倒离心管10MIN，与以上相同的离心条件。(7)吸上清，加入1/10体积的NaAc (3M，PH = 5. 2)及2倍体积预冷的无水乙醇，振荡离心管可见白色的絮状物，即DNA，于-20°C放置30min。·(8)取出冷冻后的样品，于12000rmp高速离心5_8min,弃掉上层乙醇。(9)加入lmL本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种与奶牛氧化应激相关性状检测的分子标记，其核苷酸序列如序列表SEQ？ID？NO：1所示，在该序列表SEQ？ID？NO：1中的第121bp处有一个A121？G121的碱基突变，导致Hae？Ⅲ？RFLP多态性；以及，在该序列的第149bp处有一个C149？T149的碱基突变，导致Alu？Ⅰ？RFLP多态性。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：易建明，周雄涛，张淑君，张军伟，张琨，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：
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