本发明专利技术公开了一种从猕猴桃叶片中提取RNA的方法,该方法包括(1)猕猴桃叶片的前处理,用异硫氰酸胍的酒精溶液去除猕猴桃叶片中的多糖、多酚类杂质,避免多糖、多酚类物质对猕猴桃RNA提取的影响,(2)猕猴桃叶片中总RNA的提取,(3)猕猴桃RNA的纯化。利用本发明专利技术方法提取猕猴桃叶片中的RNA,可有效去除叶片中多糖、多酚类物质对猕猴桃RNA提取的影响,使提取的猕猴桃RNA纯度高、品质好并保持较好的完整性。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种RNA的提取方法,具体指从猕猴桃叶片中提取RNA的新方法。
技术介绍
猕猴桃叶片中总RNA提取质量的好坏是猕猴桃转基因育种反转录合成cDNA成败的关键之一,通过提取猕猴桃叶片中的RNA并结合其它生物技术可获得各种特性的转基因猕猴桃新品种,使得猕猴桃叶片中RNA的提取具有重要应用价值。猕猴桃叶片中可溶性多糖、多酚的含量较高,而多糖、多酚的许多理化性质和RNA相似,易与RNA形成难溶的胶状物共沉淀,造成RNA产量减少,或者多糖、多酚溶解后形成黏稠的溶液污染RNA样品,造成RNA质量降低,从而影响转基因猕猴桃的育种。·现有技术中,Trizol法是大部分植物RNA提取的通用方法,但不适合用于猕猴桃等多糖多酚类植物RNA的提取,用Trizol法提取猕猴桃叶片中RNA时,样品在Trizol缓冲液中很快褐化,在用氯仿抽提时上清液成胶状,多糖多酚的影响非常严重,RNA很难分离,造成RNA纯度低、品质差。因此,开发猕猴桃叶片中RNA的提取新方法,保证猴桃叶片中RNA提取的完整、高纯度和较高的提取率具有重要意义。
技术实现思路
为解决猕猴桃叶片中RNA提取的技术问题,本专利技术人通过大量试验,终于专利技术出一种从猕猴桃叶片中提取RNA的新方法,运用该方法,能保证猴桃叶片中RNA提取的完整、高纯度和较高的提取率。本专利技术包括以下几个步骤 (I)猕猴桃叶片的前处理。将刚摘取的猕猴桃叶片剪碎后,立即投入质量分数为2% —4%的异硫氰酸胍的50% — 80%的乙醇溶液中,猕猴桃叶片与溶液的质量体积比为I :50 —I :200 (质量的单位为克,体积的单位为毫升),常温下浸提I 一 3小时。(2)猕猴桃总RNA的提取。将RNA提取缓冲液于55 — 75°C水浴锅中温育30 -40分钟,立即取上述处理的叶片加缓冲液于研钵中快速研磨(叶片与缓冲液的质量体积比为1:10-1 :30,质量的单位为克、体积的单位为毫升,研磨过程中加液氮以防止RNA降解)。把研磨好的,成粘稠状的匀浆液移入离心管中,55 - 75°C温育5 - 15分钟,加入等体积的氯仿和异戊醇的混合溶液(氯仿和异戊醇的体积比为20 : I 一 30:1),上下剧烈震荡10-90秒,然后于O — 20°C,5000 — 20000 g,离心5 — 60分钟。取上清,重复上述抽提步骤2-4次。取上清,加入上清液1/5 - 1/2体积的5 - 15M LiCl溶液并混匀,_10°C — _50°C条件下放置10-20小时,使RNA沉淀。O — 20°C,5000 — 20000 g,离心5 — 60分钟,弃上清,获粗提的总RNA沉淀。RNA提取缓冲液是一种水溶液,这种溶液中CTAB的质量分数为2%,、PVP40的质量分数为 2%-5%、Tris-Cl 的浓度为 100 mM (pH 8. O)、EDTA 的浓度 25 mM (pH 8. O), NaCl的浓度为2 Μ,β -ME的质量分数为2-5% (用时加入)。(3)猕猴桃RNA的纯化。加入DEPC处理过的水溶解上述得到的总RNA(水与总RNA的体积质量比为5:1-20:1,体积的单位为ml,质量的单位为g),再加入DEPC处理过的水1/30 - 1/3 体积的 I — 10 M NaAc,1-10 体积的 90 % — 98 % 的乙醇。置于-5°C — -50°C,1-5小时,使RNA沉淀。O — 20°C,5000 — 20000 g,离心5 — 60分钟,弃上清,用50% —95%乙醇清洗沉淀,空气中干燥后即得RNA。(得到的RNA可加入DEPC处理过的水溶解,保存于_70°C备用或直接用无水乙醇溶解保存)。上述操作过程中,所有的器皿均经过杀灭RNA酶活性处理,使提取的RNA不被破坏;所涉及的酒精浓度,指的是体积比。通过本专利技术得到的猕猴桃RNA经1%琼脂糖凝胶电泳检测,见两条清晰的条带,且两条带亮度比为1.8:1 — 2. 2:1,紫外分光光度计测定A260nm 和A280nm比值,比值在I. 9-2. O之间,是高品质的RNA。本专利技术的特点是以猕猴桃叶片为材料,用异硫氰酸胍酒精溶液先去除叶片中的多糖、多酚类杂质,避免多糖、多酚类物质对猕猴桃RNA提取的影响,使提取的猕猴桃RNA纯度高、品质好;用异硫氰酸胍酒精溶液去除叶片中多糖、多酚类杂质的同时还保持了 RNA的完整性。具体实施例方式 以下对猕猴桃叶片中RNA的具体提取方法进行详细说明。实施例I : (I)猕猴桃叶片的前处理。将刚摘取的猕猴桃叶片剪碎后,立即投入质量分数为2. 2%的异硫氰酸胍的55%的乙醇溶液中,猕猴桃叶片与溶液的质量体积比为I :60,常温下浸提I. 5小时。(2)猕猴桃总RNA的提取。将RNA提取缓冲液于65°C水浴锅中温育32分钟,立即取上述处理的叶片加缓冲液于研钵中快速研磨(叶片与缓冲液的质量体积比为I :15)。把研磨好的,成粘稠状的匀浆液移入离心管中,65°C温育10分钟,加入等体积的氯仿和异戊醇的混合溶液(混合溶液中氯仿和异戊醇的体积比为24 : 1),上下剧烈震荡20秒,然后于40C>12000 g,离心10分钟。取上清,重复上述抽提步骤2次。取上清,加入上清液1/4体积的8M LiCl溶液并混匀,-20°C条件下放置12小时,使RNA沉淀。4°C、12000 g,离心10分钟,弃上清,获粗提的总RNA沉淀。(3)猕猴桃RNA的纯化。加入DEPC处理过的水溶解上述得到的总RNA(水与总RNA的体积质量比为10:1),再加入DEPC处理过的水1/10体积的5 M NaAc,5体积的95%的乙醇。置于_20°C,2小时,使RNA沉淀。4°C、12000 g,离心10分钟,弃上清,用80%乙醇清洗沉淀,空气中干燥后即得RNA。通过上述方法得到的猕猴桃RNA经1%琼脂糖凝胶电泳检测,见两条清晰的条带,且两条带亮度比为1.9:1,紫外分光光度计测定么26011111和A280nm比值,比值为1.92。实施例2: (I)猕猴桃叶片的前处理。将刚摘取的猕猴桃叶片剪碎后,立即投入质量分数为3. 6%的异硫氰酸胍的75%的乙醇溶液中,猕猴桃叶片与溶液的质量体积比为I :150,常温下浸提2. 5小时。(2)猕猴桃总RNA的提取。将RNA提取缓冲液于60°C水浴锅中温育37分钟,立即取上述处理的叶片加缓冲液于研钵中快速研磨(叶片与缓冲液的质量体积比为I :26)。把研磨好的,成粘稠状的匀浆液移入离心管中,60°C温育14分钟,加入等体积的氯仿和异戊醇的混合溶液(混合溶液中氯仿和异戊醇的体积比为29 : 1),上下剧烈震荡60秒,然后于30CUlOOO g,离心15分钟。取上清,重复上述抽提步骤3次。取上清,加入上清液1/3体积的12M LiCl溶液并混匀,-30°C条件下放置12小时,使RNA沉淀。3°C、11000 g,离心15分钟,弃上清,获粗提的总RNA沉淀。(3)猕猴桃RNA的纯化。加入DEPC处理过的水溶解上述得到的总RNA(水与总RNA的体积质量比为17:1),再加入DEPC处理过的水1/5体积的6 M NaAc,8体积的91%的乙醇。置于_25°C,I. 8小时,使RNA沉淀。3°C、11000 g,离心15分本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种猕猴桃叶片中RNA的提取方法,其特征在于包含以下几个步骤:(1)猕猴桃叶片的前处理。将刚摘取的猕猴桃叶片剪碎后,立即投入质量分数为2%-4%的异硫氰酸胍的50%-80%的乙醇溶液中,猕猴桃叶片与溶液的质量体积比为1:50-1:200,常温下浸提1-3小时。(2)猕猴桃总RNA的提取。将RNA提取缓冲液于55-75℃水浴锅中温育30??40分钟,立即取上述处理的叶片加缓冲液于研钵中快速研磨(叶片与缓冲液的质量体积比为1:10-1:30)。把研磨好的,成粘稠状的匀浆液移入离心管中,55-75℃温育5-15?分钟,加入等体积的氯仿和异戊醇的混合溶液(混合溶液中氯仿和异戊醇的体积比为20?:?1-30:1),上下剧烈震荡10?90秒,然后于0-20℃、5000-20000?g,离心5-60分钟。取上清,重复上述抽提步骤2-4次。取上清,加入上清液1/5-1/2体积的5-15M?LiCl溶液并混匀,?10℃-?50℃条件下放置10?20?小时,使RNA沉淀。0-20℃、5000-20000?g,离心5-60分钟,弃上清,获粗提的总RNA沉淀。(3)猕猴桃RNA的纯化。加入DEPC处理过的水溶解上述得到的总RNA(水与总RNA的体积质量比为5:1?20:1),再加入DEPC处理过的水1/30-1/3体积的1-10?M?NaAc,1-10体积的90?%-98%的乙醇。置于?5℃-?50℃,1?5小时,使RNA沉淀。0-20℃,5000-20000?g,离心5-60分钟,弃上清,用50%-95%乙醇清洗沉淀,空气中干燥后即得RNA。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员:田宏现,彭司英,
申请(专利权)人:吉首大学,
类型:发明
国别省市:
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