一种亲本特异位点测序克隆基因的方法技术

本发明专利技术公开了一种亲本特异位点测序克隆基因的方法。其包括以下步骤：选用目标性状有差异的材料做亲本，通过两亲本杂交构建分离群体，从分离群体中选择具有隐性性状的个体构建隐性基因池；对两个亲本进行基因组高通量测序，通过初步直接组装并比对，获得显性与隐性亲本特异位点，该特异位点为目标基因的候选位点；通过富集隐性池候选位点并重测序或PCR方式逐个检查隐性池每个个体的每个候选位点的方式，确定目标基因位点；通过PCR扩增克隆全长目标基因，通过遗传互补实验验证目标基因。本发明专利技术以测序为基础，可用于任何物种，直接克隆基因本身。采用本发明专利技术的方法，工作量大为减少，速度大为加快，而且降低了风险。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于遗传学领域，公开了。
技术介绍
自然界物种性状丰富多样，如株高、抗病性、产量等。从孟德尔时代起，就逐渐认识到了性状是由遗传因子控制，摩尔根进一步将遗传因子明确为“基因”，并指出基因位于染色体上且呈线性排列。确定基因在染色体上具体的位置(基因定位)是研究性状的基础，也是分离、克隆并利用基因的前提。经典的基因定位策略源于摩尔根的连锁理论，即染色体上相邻基因(即基因连锁)不能自由分离，而是倾向于整体向后代传递，它们所控制的性状也倾向于同时出现。二者相邻越近，性状同时出现的可能性越大，重组性状越少。因此，由重组性状(配子)的比 例可以度量二者间的距离。若已知道其中一个基因在染色体上的位置(称这样的基因为标记基因)，就可以根据重组率推断另一个基因的位置。例如，黄色圆粒豌豆品种(基因型分别为YYRR)与绿色皱粒品种(基因型为yyrr)杂交产生F1 (基因型YyRr) ,F1自交可能产生YR、Yr、yR和yr4种配子，根据F2代的性状表现可以确定它们的比例，进而计算交换率。若交换率为I %，且已知控制颜色的Y基因位于第3染色体上，那么就可以推测，控制豌豆籽粒形状的R基因位于第3染色体且与Y基因相距lcM。从以上的分析可以看出，经典连锁标记定位的实质是找到与目标性状连锁的已知分子标记，并计算二者的交换率，进而推断目标基因的位置。分离群体分池是基因定位的实际操作策略，以上述实例进行说明如下。以籽粒形状为标准，将F2群体划分为两个部分(池)显性池(随机抽取的圆粒单株)和隐性池(随机抽取的皱粒单株)，比较豌豆基因组上已知的1000个SSR标记(SSR1-SSR1000)扩增产物在这两个池间的差异。若标记SSR17与籽粒形状R/r连锁，那么对籽粒形状分池，也就相当于对SSR17分池，因此，SSR17在两个池间的扩增产物是有差异的，相反就没有差异，由此确定目标基因与SSR17处于同一染色体。再分析F2各个单株的表现，计算R/r与SSR17的遗传距离，即可进一步定位R/r在该染色体上的具体位置。分子标记连锁定位基因经过几十年的发展，已成为基因定位的经典方法，但该方法依旧存在明显缺陷，主要表现如下(I)经典定位方法依赖于分子标记，分子标记分为两种，一种为通用标记，如RAPD.AFLP等，可用于任何物种，但这些标记在染色体上的位置信息不明确，因此，利用通用标记定位基因极为耗时耗力，且十分困难，利用这类标记定位的基因相当有限。另一类标记是已知染色体信息的，如SSR标记。只要找到了与性状连锁的标记，就相当于找到目标基因的大致位置，目前大部分性状是利用此类标记定位的。然而，已开发此类标记的物种只占了很少一部分，绝大部分自然界的有利基因无法通过这一方法定位、克隆和利用。(2)找到的是与目标基因连锁的分子标记，即得到的是包含目标基因的区段，而不是目标基因本身，还需要基因预测和大量验证工作以排除区段内非目标基因，当区段较大时，该工作十分困难甚至难以完成。而且易漏掉基因，如很小的蛋白分子、非编码基因等。(3)要求定位群体遗传距离大，找到连锁标记的可能性才大。从而导致一些问题。第一，过大遗传距离常导致性状偏分离，需另建群体调查性状分离比，增加了工作量。第二，远缘杂交难以用于育种，导致基因定位理论研究与育种应用实践脱节，这违背了基因定位的初衷。(4)精细定位时，连锁标记与目标基因距离很近，发现多态性标记变得越来越难，常出现无标记可用的情况。另外，相邻很近导致交换很难 发生，要获得准确的交换率，群体要求很大。而交换率计算是定量分析，需要检查群体每一个单株，工作量十分巨大
技术实现思路
本专利技术实施例的目的是针对上述现有技术的缺陷，提供了一种能够准确、快速克隆目标基因的未本特异位点测序克隆基因的方法。为了实现上述目的本专利技术采取的技术方案是，其特征在于，包括以下步骤选用遗传距离近但目标性状有差异的材料做亲本，通过两个亲本杂交构建群体，从分离群体中选择具有隐性性状的个体构建隐性基因池，对两个亲本进行基因组高通量测序，通过初步、de novo(直接)组装并比对，获得显性与隐性亲本特异位点，将它们定义为目标基因的候选位点；通过富集隐性池候选位点并重测序或PCR方式逐个检查隐性池每个个体的每个候选位点的方式，确定目标基因座位；通过PCR扩增克隆全长目标基因，通过遗传互补实验验证目标基因。本专利技术更具体的技术方案是，包括以下步骤(I)构建分离群体利用分别含有相对性状的亲本杂交后构建分离群体；(2)隐性池的获得随机选择分离群体中目标性状为隐性的个体组成隐性池；(3)DNA提取取两个亲本的叶片或其它组织，分别提取并获得两个亲本的基因组DNA ;从隐性池中每个体上取等量组织混合后提取DNA，或从每个个体中提取DNA后等量混合，获得隐性池DNA ；(4)确定候选位点按高通量测序流程构建2个亲本文库，PCR并高通量测序；初步组装亲本基因组后，比对2个亲本基因组DNA，分别获得显性亲本与隐性亲本中的特异位点，将这些特异位点定义为目标基因候选位点；(5)目标位点的确定通过两个方式确定目标位点；第一种候选位点超过50个时，通过杂交(如安捷伦SureSelect平台)或PCR方式在隐性池中富集候选位点后再次高通量测序，检测显性亲本中特有的候选位点是否在隐性池中出现，若没有出现，则为目标性状的基因位点。第二种候选位点不足50个时，可采用普通PCR、实时PCR或高通量的OppenArray的检测方式，逐个检查隐性池每个个体的每个候选位点。同样,没有出现的显性座位位点即为目标位点。(6)基因克隆与功能验证通过比对亲本基因组的方式获得基因的全长序列，PCR扩增克隆目标基因，按通用的遗传互补实验验证所克隆基因的功能。所述亲本杂交构建分离群体最好利用遗传距离近的纯系亲本构建，且距离越近越好。 本专利技术实施例的有益效果是(I)可应用于任何物种。经典克隆方法依赖于分子标记，目前大部分物种分子标记发展还不成熟，应用受限。本专利技术以测序为基础，不需要分子标记，可应用于任何物种，大大拓宽了对自然界基因利用的范围，对基因克隆产生了实质性的进步。(2)直接克隆基因本身。传统方法克隆基因之前需要定位基因，获得的是包含目标基因的区域，本专利技术直接克隆了目标基因。(3)工作量大为减少，速度大为加快。传统克隆方法耗时数年是很正常的，本专利技术群体构建完成后，只需要提取3份DNA、富集I份DNA，并进I次或2次高通量测序即可完成实验，可在数月内完成，工作量大为减少，速度大为加快。(4)风险大为降低。传统克隆方法常因缺乏足够或合适的标记而失败。本专利技术技术方案中，只要保证测序覆盖度，即可发现目的基因。大部分步骤有概率保证，具有判断的标准。比如，在隐性池中测得的序列，可以与显性亲本或隐性亲本序列组成比较，以排除测序误差、基因突变等偶然因素的影响。附图说明图I是本专利技术实施例I提供的基因克隆方法流程示意图；图2是本专利技术实施例2提供的水稻高杆基因克隆方法流程示意图。具体实施例方式下面结合附图和具体实施例对本专利技术作进一步说明，但不作为对本专利技术的限定。实施例I :(参见图I)(I)构建分离群体选择具有相对目标性状的两个亲本进行正反交(除目标性状外，其它性状差异越小越好，可通过突变株/野生株或回交育种产生姊妹系等方式创造亲本)本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种亲本特异位点测序克隆基因的方法，其特征在于，包括以下步骤：选用目标性状有差异的材料做亲本，通过两亲本杂交构建分离群体，从分离群体中选择具有隐性性状的个体构建隐性基因池；对两个亲本进行基因组高通量测序，通过初步直接组装并比对，获得显性与隐性亲本特异位点，该特异位点为目标基因的候选位点；通过富集隐性池候选位点并重测序或PCR方式逐个检查隐性池每个个体的每个候选位点的方式，确定目标基因位点；通过PCR扩增克隆全长目标基因，通过遗传互补实验验证目标基因。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：彭海，张静，章伟雄，
申请(专利权)人：江汉大学，
类型：发明
国别省市：