本发明专利技术公开了一种提高上面发酵小麦啤酒中4-乙烯基愈创木酚含量的方法，将枯草芽孢杆菌Bacillus?subtilis的PADC基因进行克隆，保留其遗传特性，使其在大肠杆菌中表达，并将该PADC基因转化至上面发酵酵母菌株W303-1A中，以构建一株上面发酵啤酒酵母W303+padc。本方法可显著提高上面发酵小麦啤酒中的4-乙烯基愈创木酚含量，突出小麦啤酒典型的丁香花味。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种利用基因工程技术提高啤酒中4-乙烯基愈创木酚含量的方法，属于基因工程
技术介绍
4-乙烯基愈创木酚感官阈值很低，仅为O. 3mg/L,即使痕量，也能使啤酒呈现药房味、酚味、丁香味或烟熏味，因而在大多数下面发酵啤酒中，其风味并不受欢迎，并且被称作是“酹异味(phenolic off-flavour)”。尽管对下面发酵啤酒而言是异味物质,但是众所周知，4-乙烯基愈创木酚却是形成比利时白啤酒(用未发芽的小麦酿造)、德国小麦啤酒(用小 麦芽酿制)以及烟熏啤酒等上面发酵啤酒的必不可少的香味物质，也是该类啤酒全面风味评价不可或缺的特色成分。在啤酒酿造过程中，通过水解和酶解作用，许多酚酸会游离出来，在上面发酵啤酒酵母中酚酸脱羧酶的作用下，可以将其中的酚酸脱羧，形成4-乙烯基愈创木酚(呈丁香花味)等特色风味物质，可以显著地提高上面发酵小麦啤酒的香味。目前4-乙烯基愈创木酚主要是通过化学或生物法进行合成。如中国专利文献CN101885669A (申请号201010229531. X)公开了一种4-乙烯基愈创木酚的制备方法，步骤为(1)向反应器中依次投入喹啉、阿魏酸和作为阻聚剂的对苯二酚，打开加热装置，接通氮气保护装置，到体系无气体溢出停止加热，继续搅拌40-60分钟；(2)将上述反应中加入溶剂苯中搅拌均匀，并向该溶液中加入盐酸，搅拌均匀，然后静置分层，检测水相pH值为中性为止；最后向去离子水洗后的溶液中加入干燥剂无水氯化钙；(3)将干燥后的溶液放入蒸馏器中，在常压下将作为溶剂的苯蒸出，然后连接上真空泵在100°C以下的气相温度下将产品蒸出即可。由于该方法产生部分副产物及原料残留，无法直接添加到啤酒酿造过程中。中国专利文献CN101397568A (申请号200810233517. X)公开了一种通过基因克隆的方法获得ENTEROBACTER SP. PX6-4中分解阿魏酸生成4-乙烯基愈创木酚的关键酶阿魏酸脱羧酶的编码区序列、并通过异源表达技术在大肠杆菌(E. COLI BL21)中大量表达了该酶；通过纯化的方法获得了阿魏酸脱羧酶的纯品；运用悬滴结晶法得到阿魏酸脱羧酶的蛋白质结晶，并且掌握了该酶的结构及活性中心。由于阿魏酸是4-乙烯基愈创木酚的前体物质，在啤酒酿造过程中添加阿魏酸脱羧酶，虽然能够提高啤酒中的4-乙烯基愈创木酚含量，但效果无法满足实际需求。事实上，部分细菌和真菌含有PADC基因，编码酚酸脱羧酶(phenolic aciddecarboxylase),在生物的降解代谢过程中起着非常重要的作用，例如不动杆菌Acinetobacter、突光假单胞菌 Pseudomonasfluorescens 和枯草芽抱杆菌 Bacillussubtilis等，但PADC基因应用于啤酒酿造工艺中尚未见报道。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术的不足，提供了一种利用基因工程技术。一种，步骤如下(I)从枯草芽孢杆菌中通过PCR扩增PADC基因，PADC基因核苷酸序列如SEQ IDNO. I所示，PCR扩增引物序列如下上游引物F-padc5，~GCGTCTAGAATGGAAAACTTTATCG~3，下游引物R-padc5’~GCGAAGCTTTTATAATCTTCCCGC~3，；(2)将步骤(I)制得的PADC基因经纯化后，经内切酶XbaI和内切酶HindIII双酶切后与同样经内切酶XbaI和内切酶HindIII双酶切的质粒YEp352连接，制得重组质粒YPADC，将重组质粒YPADC转化至上面发酵酵母W303-1A，获得上面发酵重组酵母菌株W303+padc ；·(3)利用11° P麦汁对步骤(2)制得的上面发酵重组酵母菌株W303+padc进行扩大培养，培养条件为25 28°C摇床，220 240r/min，获得上面发酵酵母W303+padc ；(4)将步骤(3)制得的上面发酵酵母W303+padc接种于11° P麦汁中，在温度为16 18°C进行发酵培养至糖度为4° P时，密封发酵容器保压至双乙酰含量低于O. lmg/L,降温至O 2°C，保存5 8天，制得4-乙烯基愈创木酚含量为I. 6 I. 8mg/L的啤酒。根据本专利技术优选的，所述步骤(I)中，PCR反应程序为94°C预变性3min ;94°C模板变性30s，52. 6°C引物退火30s，72°C引物延伸45s, 30个循环；72°C延伸IOmin0根据本专利技术优选的，所述步骤(2 )中，重组质粒YPADC转化上面发酵酵母W303-1A采用醋酸锂转化法。根据本专利技术优选的，所述步骤(3)和步骤(4)中的11° P麦汁的制备方法如下大麦芽和小麦芽按重量比3 2混合后，以EBC标准磨进行粉碎，采用浸出糖化法经糖化后，经过滤、煮沸后，制得11° P麦汁。根据本专利技术进一步优选的，上述糖化的具体步骤为投料温度为37°C，保持20min ;升温至45°C保持30min，然后升温至52°C保持40min ;再升温至65°C，保持70min ；最后升温至78°C浸出即可。有益效果本专利技术首次通过对上面发酵酵母进行基因工程改造获得具有特殊功能的啤酒酵母，并将该酵母用于啤酒酿造，从而显著提高了上面发酵小麦啤酒中的4-乙烯基愈创木酚含量，突出了上面发酵小麦典型的丁香花味。该方法为改善啤酒口味和香味提供了新的方法，为基因工程应用于啤酒酿造领域奠定了基础。附图说明图I为PCR获得的PADC基因的电泳图；其中M为 D2000DNA Marker, 1、2、3、4、5、6、7 为 PADC 基因；图2为质粒YEp352与PADC基因PCR纯化产物的双酶切电泳图；其中A为Ikb DNA Maker，B为 YEp352质粒，C为PADC PCR纯化产物，D为D2000DNAMaker ；图3为重组质粒YPADC的构建过程示意图；图4为重组质粒YPADC的酶切鉴定电泳其中M为Ikb DNAMarker, I为XbaI和HindIII双酶切重组质粒YPADC，2为重组质粒YPADC，3为XbaI和HindIII双酶切质粒YEp352，4为XbaI和HindIII双酶切PADC基因，5 为 D2000DNAMarker ；图5为克隆菌株W303+padc的菌落PCR验证电泳图；其中M-D2000DNAMarker，I 为出发菌株 W303-1A，2 21 为克隆菌株 W303+padc ；图6为出发菌株W303-1A和克隆菌株W303+padc的SDS-PAGE电泳图；其中M为marker，I为出发菌株W303-1A，2为克隆菌株W303+padc ；图7为出发菌株W303-1A和克隆菌株W303+padc酶活性的柱状对比示意图； 图8为出发菌株W303-1A和克隆菌株W303+padc酿造的啤酒的外观浓度和双乙酰含量变化曲线图；图9为出发菌株W303-1A和克隆菌株W303+padc酿造的啤酒的4_乙烯基愈创木酚含量柱状对比示意图；图10为出发菌株W303-1A和克隆菌株W303+padc酿造啤酒的感官品评示意图。具体实施例方式下面结合实施例对本专利技术的技术方案做进一步说明，但本专利技术所保护范围不限于此。生物材料来源枯草芽孢杆菌购自上海勒布生物科技有限公司，商品编号为ACCC1062本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种提高上面发酵小麦啤酒中4？乙烯基愈创木酚含量的方法，其特征在于，步骤如下：（1）从枯草芽孢杆菌中通过PCR扩增PADC基因，PADC基因核苷酸序列如SEQ？IDNO.1所示，PCR扩增引物序列如下：上游引物：F？padc5’？GCG？TCTAGA？ATGGAAAACTTTATCG？3’下游引物：R？padc5’？GCG？AAGCTT？TTATAATCTTCCCGC？3’；（2）将步骤（1）制得的PADC基因经纯化后，经内切酶XbaI和内切酶HindIII双酶切后与同样经内切酶XbaI和内切酶HindIII双酶切的质粒YEp352连接，制得重组质粒YPADC，将重组质粒YPADC转化至上面发酵酵母W303？1A，获得上面发酵重组酵母菌株W303+padc；（3）利用11°P麦汁对步骤（2）制得的上面发酵重组酵母菌株W303+padc进行扩大培养，培养条件为：25～28℃摇床，220～240r/min，获得上面发酵酵母W303+padc；（4）将步骤（3）制得的上面发酵酵母W303+padc接种于11°P麦汁中，在温度为16～18℃进行发酵培养至糖度为4°P时，密封发酵容器保压至双乙酰含量低于0.1mg/L，降温至0～2℃，保存5～8天，制得4？乙烯基愈创木酚含量为1.6～1.8mg/L的啤酒。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：崔云前，周广田，
申请(专利权)人：山东轻工业学院，
类型：发明
国别省市：
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