本发明专利技术公开了铁皮石斛人工种子的制作和贮藏方法，包括以下步骤：(1)原球茎的诱导；(2)原球茎的液体悬浮培养增殖；(3)人工种子的制作；(4)人工种子的贮藏；与现有技术相比，本发明专利技术以液体悬浮培养(1/2MS培养基)增殖铁皮石斛原球茎，增殖效率较现有发明专利技术的固体培养基(MS培养基)增殖培养有显著提高，为人工种子生产提供了大量优质的人工种胚；本发明专利技术以海藻酸钠和硝酸钙溶液离子交换固化形成人工种皮，与现有发明专利技术的海藻酸钠和氯化钙溶液反应相比，制成的人工种子形状更规则、营养物质泄漏率较低；人工种子贮藏寿命延长，且发芽率较高。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于植物生物
，具体涉及一种。
技术介绍
铁皮石斛(Dendrobium candicum Wall, ex Lindl.),又名黑节草，为兰科多年附生草本植物。铁皮石斛具有重要的药用价值，始载于东汉《神农本草经》，以鲜茎或干燥茎入药，具益胃生津、滋阴清热之效；道家医学典籍《道藏》将其列为“九大仙草”之首，民间将其奉为“救命仙草”；《中华人民共和国药典》记载其可用于阴伤津亏，口干烦渴，胃阴不足，食少干呕，病后虚热不退，阴虚火旺，骨蒸劳热，目暗不明，筋骨痿软。现代药理学分析铁皮石斛具有增强机体免疫力、抗肿瘤、降血糖、抗氧化等作用，是许多中成药和保健品的重 要原料。铁皮石斛对生长环境要求特殊，加之长期无节制的采挖，导致其野生资源日益减少，濒临枯竭，已被列为中国珍稀濒危二级保护植物。铁皮石斛的种子细小，缺乏胚乳，且需与兰菌共生才能萌发，因此其自然繁殖率极低，难以满足大规模人工栽培的需要。传统的分株、扦插等繁殖方式繁殖率也较低。利用组织培养技术虽然能在一定程度上解决快速繁殖的难题，但是依然存在试管苗转接次数多、生产周期长、成本高、移栽成活率低且贮藏和运输不便等问题，同样限制了铁皮石斛的大规模生产。人工种子技术可以将无菌生长的原球茎经过包埋之后直接播入土壤，为铁皮石斛的生产提供了一条新的途径。与试管苗相比，人工种子减少了生根和驯化移栽的过程，缩短了生产周期，大大降低了生产成本。但是铁皮石斛人工种子的研究刚刚起步，还存在着发芽率低、贮藏时间短和田间成苗率低等亟待解决的问题。中国专利申请号200910193294. 3，一种铁皮石斛人工种子的制作方法，提供了一种铁皮石斛人工种子的制作方法，但其增殖效率较低，生产成本较高，人工种子贮藏寿命短，且发芽率萌发率较低。
技术实现思路
本专利技术所要解决的主要问题是珍稀药用植物铁皮石斛的人工种子制作和贮藏技术，旨在利用现代生物技术有效缓解铁皮石斛野生资源濒临枯竭和大规模人工栽培种苗短缺的局面，充分满足人类生活中对铁皮石斛的需求。为了达到上述目的，本专利技术采用以下技术方案，包括以下步骤(I)原球茎的诱导将铁皮石斛成熟但尚未开裂的蒴果在自来水下冲洗l_2h，放入超净工作台中，先用75%酒精浸泡O. 5-lmin，无菌水冲洗3-5次，再用O. I %氯化汞溶液浸泡8_10min，无菌水冲洗3-5次，置于无菌滤纸上吸干表面水分，用解剖刀将蒴果切开，将蒴果内种子均匀撒播在原球茎诱导培养基上，置于25°C人工气候箱中，先进行5d黑暗培养，然后转入光照培养，光照强度为20001x，每日光照时间为16h，培养15d后种子萌发形成绿色的原球茎；原球茎诱导培养基组成为MS+O. 5mg/L萘乙酸+30g/L蔗糖+10%土豆汁+0. 5%活性炭+0. 7%琼月旨，pH 5. 8，培养基预先在121°C下高压灭菌15-20min ；(2)原球茎的液体悬浮培 养增殖将诱导获得的铁皮石斛原球茎接种于液体增殖培养基中进行悬浮培养，每瓶装培养基25-30ml，接种原球茎重量为I. 5-2. 0g，将培养瓶置于25°C恒温摇床上振荡培养，转速为80-100r/min，光照为自然漫射光，每培养15d更换一次培养液；原球茎液体增殖培养基配方为1/2MS+0. 5mg/L萘乙酸+2. Omg/L 6-苄氨基嘌呤+30g/L蔗糖+0. 1-0. 5g/L聚乙烯吡咯烷酮，pH 5.8，其中1/2MS为大量元素减半的MS基本培养基;(3)人工种子的制作以MS+0.5mg/L 萘乙酸+2.5mg/L 6-苄氨基嘌呤+30g/L 蔗糖+0. 3-0. 4wt % 多菌灵+0. 2wt%活性炭+20mg/L脱落酸为人工胚乳，在其中加入3-4wt%海藻酸钠熬制成半凝胶，经121 °C高压灭菌20min后冷却备用，在超净工作台上，将经过30d液体悬浮增殖培养的大小为2-4mm的铁皮石斛原球茎均匀悬浮于半凝胶中，用内直径为4mm的滴管吸取半凝胶和原球茎滴入已灭菌冷却的50-150mmol/L硝酸钙溶液中，保证每滴半凝胶中只含有一颗原球茎，经过20-30min离子交换反应，倒去硝酸钙溶液，用无菌水漂洗3次即可得到人工种子;(4)人工种子的贮藏在超净工作台上，将制得的人工种子置于无菌滤纸上吸干表面水分，再将其放入已灭菌烘干的三角瓶中，用封口膜密封好后，放置在4°C冰箱中黑暗保存。与现有技术相比，本专利技术存在以下有益效果I.本专利技术以液体悬浮培养(1/2MS培养基)增殖铁皮石斛原球茎，增殖效率较现有专利技术的固体培养基(MS培养基)增殖培养有显著提高，为人工种子生产提供了大量优质的人工种胚；2.本专利技术以海藻酸钠和硝酸钙溶液离子交换固化形成人工种皮，与现有专利技术的海藻酸钠和氯化钙溶液反应相比，制成的人工种子形状更规则、营养物质泄漏率较低；3.本专利技术在人工胚乳中添加多菌灵，而现有专利技术添加的是百菌清，与其相比较人工种子在有菌基质中有较高的萌发率；4.本专利技术在人工胚乳中添加脱落酸并将人工种子置于4°C冰箱中保存，贮藏6个月后仍具有较高的萌发率，而现有专利技术未添加脱落酸并进行贮藏发芽试验。本专利技术发现随着贮藏时间的延长，不添加脱落酸的人工种子萌发率迅速降低，在贮藏5个月后种子萌发率降为O ;添加20mg/L脱落酸的人工种子萌发率随贮藏时间延长降低较慢，贮藏6个月后萌发率仍可达45%。5.本专利技术的原球茎诱导培养基组成为MS+0. 5mg/L萘乙酸+30g/L蔗糖+10% wt土豆汁+0. 5wt%活性炭+0. 7wt%琼脂，而现有专利技术的种子萌发培养基以MS培养基为基本培养基，每升含椰子汁50-100ml，活性炭10g，蛋白胨l_2g，蔗糖20_30g，琼脂8_9g，pH值为5. 4-5. 6。本专利技术培养基中添加的土豆汁可以自己自作，比用椰子汁和蛋白胨成本低。具体实施例方式以下结合具体实施例，对本专利技术进行详细说明。实施例一I.原球茎的诱导将铁皮石斛成熟但尚未开裂的蒴果在自来水下冲洗2h，放入超净工作台中，先用75%酒精浸泡O. 5-lmin，无菌水冲洗3-5次，再用O. I %氯化汞溶液浸泡8_10min，无菌水冲洗3-5次，置于无菌滤纸上吸干表面水分，用解剖刀将蒴果切开，将蒴果内种子均匀撒播在原球莖诱导培养基上，置于25°C人工气候箱中,先进行5d黑暗培养,然后转入光照培养,光照强度为20001x，每日光照时间为16h，培养15d后种子萌发形成绿色的原球茎。原球茎诱导培养基组成为MS+0. 5mg/L萘乙酸+30g/L蔗糖+10wt%土豆汁+0. 5wt%活性炭+0. 7wt%琼脂，pH 5. 8，培养基预先在121°C下高压灭菌20min。 2.原球茎的液体悬浮培养增殖将诱导获得的铁皮石斛原球茎接种于液体增殖培养基中进行悬浮培养，每瓶装培养基25-30ml，接种原球茎重量为I. 5_2g，将培养瓶置于25°C恒温摇床上振荡培养，转速为80r/min,光照为自然漫射光，每培养15d更换一次培养液。原球茎液体增殖培养基配方为1/2MS+0. 5mg/L萘乙酸+2. Omg/L 6-苄氨基嘌呤+30g/L蔗糖+0. lg/L聚乙烯吡咯烷酮，pH5. 8，其中1/2MS为大量元素减半的MS基本培养基。3.人工种子的制作以MS+0.5mg/L 萘乙酸+2本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种铁皮石斛人工种子的制作和贮藏方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)原球茎的诱导：将铁皮石斛成熟但尚未开裂的蒴果在自来水下冲洗1？2h，放入超净工作台中，先用75％酒精浸泡0.5？1min，无菌水冲洗3？5次，再用0.1％氯化汞溶液浸泡8？10min，无菌水冲洗3？5次，置于无菌滤纸上吸干表面水分，用解剖刀将蒴果切开，将蒴果内种子均匀撒播在原球茎诱导培养基上，置于25℃人工气候箱中，先进行5d黑暗培养，然后转入光照培养，光照强度为2000lx，每日光照时间为16h，培养15d后种子萌发形成绿色的原球茎；原球茎诱导培养基组成为MS+0.5mg/L萘乙酸+30g/L蔗糖+10％上豆汁+0.5％活性炭+0.7％琼脂，pH？5.8，培养基预先在121℃下高压灭菌15？20min，(2)原球茎的液体悬浮培养增殖将诱导获得的铁皮石斛原球茎接种于液体增殖培养基中进行悬浮培养，每瓶装培养基25？30ml，接种原球茎重量为1.5？2.0g，将培养瓶置于25℃恒温摇床上振荡培养，转速为80？100r/min，光照为自然漫射光，每培养15d更换一次培养液；原球茎液体增殖培养基配方为1/2MS+0.5mg/L萘乙酸+2.0mg/L？6？苄氨基嘌呤+30g/L蔗糖+0.1？0.5g/L聚乙烯吡咯烷酮，pH？5.8，其中1/2MS为大量元素减半的MS基本培养基：(3)人工种子的制作以MS+0.5mg/L萘乙酸+2.5mg/L？6？苄氨基嘌呤+30g/L蔗糖+0.3？0.4wt％多菌灵+0.2wt％活性炭+20mg/L脱落酸为人工胚乳，在其中加入3？4wt％海藻酸钠熬制成半凝胶，经121℃高压灭菌20min后冷却备用，在超净工作台上，将经过30d液体悬浮增殖培养的大小为2？4mm的铁皮石斛原球茎均匀悬浮于半凝胶中，用内直径为4mm的滴管吸取半凝胶和原球茎滴入已灭菌冷却的50？150mmol/L硝酸钙溶液中，保证每滴半凝胶中只含有一颗原球茎，经过20？30min离子交换反应，倒去硝酸钙溶液，用无 菌水漂洗3次即可得到人工种子；(4)人工种子的贮藏在超净工作台上，将制得的人工种子置于无菌滤纸上吸干表面水分，再将其放入已灭菌烘干的三角瓶中，用封口膜密封好后，放置在4℃冰箱中黑暗保存。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：赖佳，李焕秀，许轲，唐懿，秦耀国，罗倩，朱永鹏，郑阳霞，
申请(专利权)人：四川农业大学，
类型：发明
国别省市：
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