甲基化DNA的检测制造技术

描述了离子敏场效应晶体管（ISFET）在检测DNA样品中甲基化的核苷酸中的应用。一种检测DNA样品中甲基化的核苷酸的方法，可以包括以下步骤：使用区别甲基化的和非甲基化的核苷酸的试剂处理DNA样品，以提供处理的DNA；对所述处理的DNA进行扩增；以及可选择地对扩增的DNA进行测序。将ISFET用于监测在扩增和/或测序步骤中的链延伸反应期间一个或多个dNTP的添加。还提供了合适的装置。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及一种传感装置和方法，尤其涉及一种适合检测甲基化DNA的传感装置和方法。
技术介绍
在化学科学中，甲基化表示甲基基团加入到底物上或者原子或基团被甲基基团取代。甲基化是特定的甲基基团而不是更大的碳链取代氢原子的烷基化形式。这些术语通常用在化学、生物化学、土壤科学和生物科学中。在生物系统中，甲基化由酶催化；这种甲基化可以参与重金属的修饰，基因表达的调控、蛋白功能的调控，以及RNA代谢。重金属的甲基化也可以发生在生物系统外。组织样 品的化学甲基化也是减少特定组织学染色伪差(histological staining artefacts)的一种方法。脊椎动物中的DNA甲基化通常发生在CpG位点(胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤位点；即，在DNA序列中在该位点胞嘧啶后直接为鸟嘌呤)；这种甲基化导致胞嘧啶转化为5-甲基胞嘧啶。Me-CpG的形成由DNA甲基转移酶催化。大部分哺乳动物的DNA有大约40%的CpG位点被甲基化，但存在富含GC (由大约65%的CG残基组成)的被称为CpG岛的特定区域，该区域内CpG位点不被甲基化。这些与56%的哺乳动物基因的启动子相关，所述哺乳动物基因包括所有无所不在地表达的基因。1-2%的人类基因组为CpG簇，并且在CpG甲基化和转录活性之间存在逆相关。DNA甲基化涉及在胞嘧啶嘧啶环的5位置或腺嘌呤嘌呤环的第6位氮(胞嘧啶和腺嘌呤为DNA的四个碱基中的两个)上加入甲基基团。这种修饰可以通过细胞分裂遗传。DNA甲基化通常在受精卵形成阶段被去除并且在发育阶段通过连续的细胞分裂被重建。DNA甲基化是高等生物中正常机体发育和细胞分化的重要部分。DNA甲基化稳定地改变细胞中基因的表达模式以便细胞能够“记得它们曾在何处”；换句话说，在胚胎发育期间程序化为胰岛的细胞在机体的整个生命中依然为胰岛，但没有持续的信号告诉它们需要依然为胰岛。另外，DNA甲基化抑制病毒基因和其它有毒元件(该有毒元件已随着时间整合到了宿主的基因组中)的表达。DNA甲基化也形成染色质结构的基础，这使细胞能够形成来自单一非突变的DNA序列的多细胞生命所必需的多数特征。DNA甲基化还在几乎所有类型的癌症发展中起着重要的作用。DNA甲基化涉及在DNA上加入甲基基团——例如，在胞嘧啶嘧啶环的第5位碳上——在这种情况下具有降低基因表达的特殊效果。在成人的体组织中，DNA甲基化通常发生在CpG 二核苷酸环境中；非CpG的甲基化在胚胎干细胞中是普遍的。亚硫酸氢盐测序法是利用亚硫酸氢盐处理DNA以确定它的甲基化模式。DNA甲基化是首次发现的表观遗传标记(epigenetic mark),并且仍然是研究最多的。它还参与转录活性的抑制。使用亚硫酸氢盐处理的DNA将胞嘧啶残基转变为尿嘧啶，但保留了不受影响的5-甲基胞嘧啶残基。因此，亚硫酸氢盐处理在DNA序列中引入了特定的改变，这种改变依赖于个体胞嘧啶残基的甲基化状态，产生有关DNA片段甲基化状态的单核苷酸分辨率信息(single-nucleotide resolutioninformation)。可以对改变的序列进行多种分析以获得这种信息。这种分析的目的因此变为区分由亚硫酸氢盐转变导致的单核苷酸多态性(胞嘧啶和胸腺嘧啶)。可以通过焦磷酸测序进行测序,这不同于双脱氧测序(Sanger sequencing),焦磷酸测序依赖于核苷酸掺入上释放的焦磷酸的检测，而不依赖于双脱氧核苷酸的链终止反应。使用Infinium II 平台的 Illumina 甲基化试验(Illumina Methylation Assay)利用“珠状芯片(BeadChip)”技术产生人类DNA甲基化的综合基因组图谱(comprehensivegenome wide profiling),与亚硫酸氢盐测序和焦磷酸测序相似。根据Staaf等 (2008), "Infinium II试验似乎在荧光检测中使用的两个通道之间存在染料强度偏差(dye intensity biases)。另外，即使数据通过在BeadStudio软件中使用的标准化算法(normalization algorithms)进行处理后这种偏差也没被消除。用于DNA甲基化生物标记分析的样品通常包括来自肿瘤的高浓度的背景DNA。然而，肿瘤来源的DNA因为通常以非常低的浓度存在而难以检测，而且能够被来自健康细胞的DNA大范围地污染。因此，常常需要对在大量未甲基化的背景DNA中的单拷贝的甲基化DNA具有灵敏检测能力的方法，以鉴定体液中异常甲基化的肿瘤来源的DNA。其后进行不同的分析步骤的不同类型的预处理的样品DNA的结合，导致了大量的测定DNA甲基化模式和图谱的技术。特别地，甲基化分析的方法分为3组基于限制性内切酶的、基于染色质免疫沉淀的(ChIP)或基于亲和力的以及亚硫酸氢盐转变(基于基因的)。基于限制性内切酶的方法通过结合甲基化敏感的限制性内切酶的使用和用于总甲基化分析的实验方法(RLGS，DMH等)使用甲基化敏感的限制性内切酶用于小/大范围的DNA甲基化分析，该方法可以应用于任何未知DNA序列的基因组。然而，需要大量的基因组DNA，使得当回收少量DNA时所述方法不适于样品的分析。另一方面，基于ChIP的方法对肿瘤中不同甲基化区域的鉴定是有效的，该方法通过使用针对蛋白质的抗体从溶液中沉淀出蛋白质抗原。这些方法是基于蛋白质的，广泛应用在癌症研究中。尽管这些优点，基于蛋白质的方法局限在特定位点的甲基(CH3)基团的检测，在通过限制性内切酶识别序列的频率获得的数据上有局限性，当抗体附着后需要额外扩增时变得复杂。MSP因其高分析灵敏度而著称，然而其能够被引物设计和PCR循环数影响，因此，存在由假阳性结果引起的风险，当在癌症早期识别中使用甲基化技术时，据称该风险是重大问题之一，所以，增加甲基化检测的特异性代表了在适当的早期识别试验的发展中重要的一步。本专利技术的专利技术人认识到目前的方法具有高成本的所需手段去检测荧光，并且通常与标准高容量生产工艺例如CMOS工艺不兼容
技术实现思路
根据本专利技术的第一方面,提供一种离子敏场效应晶体管(ion sensitive fieldeffect transistor) (ISFET)在检测DNA样品中甲基化的核苷酸中的应用。根据本专利技术的第二方面，提供一种检测DNA样品中甲基化的核苷酸的方法，所述方法包括以下步骤使用区别甲基化的和非甲基化的核苷酸的试剂处理DNA样品，以提供处理的DNA ；对所述处理的DNA进行扩增；以及 可选择地，对扩增的DNA进行测序；其中，ISFET监测在扩增和/或测序步骤中的链延伸反应期间一个或多个dNTP在DNA链上的添加。在扩增和合成测序期间，离子被释放或消耗。例如，当核苷酸加入到链延伸反应中·时氢离子被释放。可以通过ISFET引起的电信号输出的改变对这些离子进行检测。试剂可以是选择性地结合DNA样品中甲基化的核苷酸的甲基基团的抗体。然后可以将样品进行免疫沉淀反应，从而分离结合抗体的DNA片段(S卩，甲基化的片段)和未结合抗体的片段(即，未甲基化的片段)。在用试剂处理前，DNA样品可以经过一步或多步额外的加工。可以纯化DNA，或可以加工DNA以便将DNA链破碎为更小的片段。例如，DNA可以经超声处理(sonicatio本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：克里斯特弗·图马佐，M·卡罗佛诺，
申请(专利权)人：DNA电子有限公司，
类型：
国别省市：