本发明专利技术总的涉及转基因构建体，包含转基因构建体的转基因非人动物及其产生的方法，以及使用包含转基因构建体的转基因非人动物的方法。本发明专利技术的一个实施方案涉及无创地在全动物、组织切片或天然细胞中利用在配体结合至GPCR受体后对通道调节有应答的、包含生物发光转基因报告系统的转基因模型中检测GPCR配体活化的方法。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术总的涉及转基因构建体，包含转基因构建体的转基因非人动物及其产生的方法，以及使用包含转基因构建体的转基因非人动物的方法。本专利技术的一个实施方案涉及无创地在全动物、组织切片或天然细胞中利用在配体结合至GPCR受体后对通道调节有应答的、包含生物发光转基因报告系统的转基因模型检测GPCR配体的方法。
技术介绍
在药物研发过程中，淘汰率很高，五种化合物中只有一种能通过美国食品药品监督管理局(FDA)的批准(DiMasi, JA, et al, J Health Econ 22，151-185，2003)。此外，尽管投资大大增加了，新药物的引入在过去30年中保持相对稳定，新药类别中，每年只有两到三个有进展，最终能够上市(Lindsay MA, Nature Rev Drug Discovery, 2，831-838，2003)。 应用于药物研发初始阶段的分子和功能性成像可提供生物活性的证据并证实推定的药物对其预期的目标有效。因此，人们对在分子成像技术投资很有希望能够促进药物研发过程(Rudin M, Progress in Drug Res vol 62)。分子成像技术相对于更传统的读数方法的优势在于，它们可在完整无损的生物体中进行，并具有足够的空间和时间分辨率来研究体内的生物过程。此外，该技术还允许在不同的时间点对同一生物模型进行重复、无创、一致且相对自动化的研究，因此增加了纵向研究的统计效力，并减少所需动物的数目，因而降低了药物研究的成本。分子成像分子成像是指通过多学科(细胞和分子生物学、化学、医学、药学、物理学、生物信息学和工程学)方法的综合，在活体生物中在细胞和亚细胞水平上利用并整合成像技术来评估特定的分子过程(Massoud T. F·，Genes Dev. 17:545-580，2003)。遗传工程的出现已经给应用科学(包括例如药物研发)带来了重大的变化。同样地，动物成像技术的研发和利用为临床前研究提供了新的手段(Maggie A. and CianaP.，Nat. Rev. Drug Discov. 4，249-255，2005)。由于对生理事件进行实时定量的困难，因此传统上动物模型的使用很不方便。这些年来，已经研发出新的成像技术来克服这一困难，所述技术例如磁共振成像(MRI)和正电子发射体层照相术(PET)。最近，基于萤光素酶(即萤火虫的发光酶)的体内表达的生物发光成像已被用于无创检测。分子成像生物发光体内生物发光成像(BLI)是一种基于检测细胞或组织光发射的灵敏工具。报告基因的使用使得有可能通过体内成像方法在活体动物中分析特定细胞和生物过程。生物发光，即用酶法催化活体生物产生可见光，在很多非哺乳动物物种中是一种天然发生的现象(Contag, C. H. , et al, Mol. Microbiol. 18:593-603，1995)。萤光素酶是催化底物氧化以释放光子的酶(Greer L. F.，III，Luminescence 17:43-74, 2002) 对北美萤火虫的生物发光研究最为广泛。萤火虫萤光素酶基因((Iuc)表达产生萤光素酶，它将底物D-萤光素转化成非反应性氧化萤光素，结果在562nm产生绿色发光。由于哺乳动物组织并不能天然地产生生物发光，体内BLI具有相当大的吸引力，因为产生的图像只有很小的背景信号。BLI要求利用由选择的基因启动子(其从组成上启动发光报告基因)所控制的生物发光报告基因所组成的表达盒，对细胞或组织进行基因工程处理(图3)。为了诱发发光，例如萤光素的底物可通过脑室内(icv)、静脉内(iv)、腹膜内(ip)或皮下(sq)注射给药。萤光素酶发射的光可穿透几毫米到几厘米的组织深度，但是，每深入组织一厘米，光子强度则降低 10 倍(Contag, C. H. , et al, Mol. Microbiol. 18:593-603，1995)。必须使用灵敏的光检测仪器来检测体内生物发光。检测器测量每单位面积发射的光子数目。利用电荷耦合装置照相机可检测波长在400和IOOOnm之间的低强度光，该照相机将撞击硅晶片的光子转换成电子(Spibey CP et al electrophoresis 22:829-836,2001)。软件可将电子信号转换成二维图像。软件还可以对发射光的强度(撞击检测器的发射光子的数目)进行定量，并将这些数值转换成伪色(pseudocolor)图形或灰度图像(图2A和2B)。实际的数据是以光子测量的，但是，伪色图像允许研究人员进行快速视觉解释。对于更细微的差另O，则可能需要在感兴趣的区域进行定量测量。使用冷却的电荷耦合装置(CCD)照相机可降低热噪音，光密闭机箱可使萤光素酶产生的光实现最佳视觉化和定量(Contag C. H. andBachmann, Μ. H. , Annu. Rev. Biomed. Eng. 4:235-260，2002)。 有用的是，将萤光素酶图像叠加到另一种类型的图像上，所述图像例如发射信号解剖位置的自动绘像或射线照片(图2B)。软件可叠加图像用于可视化和解释。通过动物基因工程和分子成像技术的结合，有可能对活体动物体内的特定分子过程进行动态研究。这一方法可能潜在地影响临床前研究方案，因此正在广泛地改变医学领域的各个方面(Maggie A. Trends Pharmacolo. Sci 25, 337-342，2004)。G-蛋白偶联受体(GPCRs)-GPCRs作为药物靶点GPCRs组成了一个很大的细胞表面受体的超家族，可根据其共有的形态结构分类为100多个亚家族，GPCR亦称为七跨膜(7TM)受体。在制药行业，GPCR是最经常涉及的药物靶点。所有的上市处方药物中，大约有30%以GPCR为靶点，使得这一蛋白质家族成为药学上最成功的一类靶点(Jacoby, E; Chem. Med. Chem.，1:761-782，2006)。GPCR和其细胞外配体之间的相互作用已被证明是治疗剂的一个很有吸引力的干扰点。由于这一原因，制药行业已经研发了用于发现生物化学药物的分析方法来研究这些配体-GPCR相互作用。活化的GPCR与异源三聚体G蛋白的相互作用催化鸟苷二磷酸(⑶P)与鸟苷三磷酸(GTP)的交换，使之能与几个下游效应子相互作用(Cabrera-VeraT. M.，Endocr. Rev. 24:765-781, 2003)。下游信号取决于所研究GPCR所优选的G-α同种型。G- a q/11家族蛋白质刺激磷脂酶C(PLC)，而G- a i/0和G- a s家族的代表性蛋白质主要调节腺苷酸环化酶(AC)的活性。如果所研究的GPCR通过PLC发送信号，那么，最广泛应用的基于报告基因的测定GPCR活化的技术为一种钙(Ca+2)释放分析，或是利用Ca+2敏感的荧光团以荧光形式测量(Sullivan E, Methods Mol. Biol. 114:125-133，1999)，或利用水母发光蛋白和一个化学发光底物以发光的形式测量(Dupriez V. J. , ReceptorsChannels 8:319-330, 2002) 如果所研究的GPCR通过AC发送信号，那么，则可以利用各种检测技术测定胞衆环磷酸本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：H德雷斯勒，KD埃科诺米德斯，庞震，HG波利特斯，
申请(专利权)人：赛诺菲，
类型：
国别省市：
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