本发明专利技术涉及BLAD?CD18野生型和突变型双基因型（A/G型）杂合子质粒及其构建方法，其是通过EcoRI酶切产生黏性末端后反向连接BLAD?CD18突变基因型（G/G）片段和野生基因型片段（A/A）的连接产物，所述BLAD?CD18突变基因型（G/G）片段和BLAD?CD18野生基因型（A/A）片段的比例为1:1。构建方法主要是根据GenBank中BLAD?CD18序列设计引物，进行PCR扩增后纯化产物。本发明专利技术提供的标准质粒，为建立起方便、高效且特异的检测BLAD的方法以及为测定奶牛群中BLAD发生频率和BLAD检测试剂盒的研发奠定了基础，使大规模BLAD致病基因的筛查成为可能，以此不仅可以掌握BLAD基因携带和发病情况，还可以排除隐性有害基因的携带者，避免和降低种公牛传播扩散有害基因的风险，最终为有效预防和治疗BLAD做出贡献。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及质粒的构建方法，特别涉及一种BLAD CD18野生型和突变型双基因型(A/G型)杂合子质粒及其构建方法。
技术介绍
奶牛白细胞黏附缺陷症(bovineleukocyte adhesion deficiency,BLAD)是一种发生于发生于荷斯坦(Holstein)奶牛的常染色体的隐性致死性的遗传性免疫缺陷疾病，其致病机理和人的白细胞黏附缺陷病(leukocyte adhesion deficiency, LAD)相同，是由白细胞表面的整合素i32(CD18)所编码区域的基因序列中第383位的碱基A突变为G所引起的，与之对应的天门冬氨酸变为甘氨酸，导致白细胞表面的整合素β 2表达量明显减少或缺乏，不能与整合素a亚单位(CDll)以非共价键相连构成异源二聚体而形成整合素分子，进而在发生炎症时外周血液中的中性粒细胞无法通过表面的整合素糖蛋白分子与血管内皮黏附分子相互作用而黏附到血管内皮上，进而无法穿过血管壁在基质中向炎性部位趋化，也就无法最终到达病原侵入部位，对病原体直接做出反应。但由于病原不断的刺激，机体的白细胞不断增多，久之造成了机体的免疫力低下。BLAD多发生于1-14月龄的荷斯坦牛，双亲均可为携带者。临床表现为严重的反复性感染、脓液形成减弱、伤口愈合缓慢和白细胞增多，同时表现为犊牛初生体重低和发育 迟缓等症状。出生小牛为致病纯合体时，临床上表现发病，为反复性感染发炎、生长发育受阻、嗜中性粒细胞增多等症状，通常很快死亡，所以BLAD常见于不到I岁的荷斯坦牛。BLAD的主要症状是食欲不好，鼻镜肿胀、有脱斑。广泛的淋巴结增生，颌下淋巴结肿大，为正常的3-5倍，口腔黏膜、齿龈黏膜坏死性溃疡，齿龈萎缩，病程长者前白齿脱落。上、下颌骨增厚，发生骨质吸收和溶解。轻度腹泻，胃炎、小肠肠炎，回肠发生溃疡性肠炎。慢性咳嗽，有的表现为伪膜性鼻炎、坏死性喉炎、卡他性支气管肺炎，还可观察多发性肺坏死灶。加耳标签所造成的损伤可引起耳脓肿变形，渗出物为黄色清水样。病牛还表现不爱运动，生长缓慢，严重者体重仅为正常体重的40%，胸腹侧水肿较明显。患牛需要频繁或长期的抗生素治疗。发病较轻者，采用这种方法可存活一定时间，但不能得到根本上的治疗。近30年来，我国从美国、加拿大及澳大利亚等进口大量的活牛，其中大部分为荷斯坦牛，由于BLAD有害基因多以杂合的状态存在，携带者并不发病，加之对此病没有足够的认识和重视，不可避免地引入大量潜在的BLAD携带者，而携带者表现正常，很难发现，一旦被发现时，其已经在畜群中进行了长时期的传播。BLAD患牛出生后生长发育极差，其中绝大多数在I年内死亡，只有极少数可存活2年左右，而幸存到2年左右的奶牛没有繁殖和哺育能力，从长期来看，引入有害基因将给中国养牛业和乳制品行业的发展带来重大的经济损失。BLAD遗传缺陷的发现引起了各国奶牛育种协会和育种工作者的重视，美国、日本、丹麦、荷兰等国已相应建立了种公牛遗传缺陷基因的分子检测方法和育种计划，将BLAD造成的损失降低。我国拥有700万头以上的荷斯坦奶牛，由于缺乏简便有效的BLAD隐性有害基因的检测方法，无法开展常规检测和大规模的普查统计，因此对我国牛群中BLAD的发病和携带情况尚不十分清楚，也就更谈不上从牛群中净化BLAD。我国急需建立快速、敏感、稳定可靠的BLAD检测方法，开展积极的BLAD致病基因筛查，从而阻断BLAD致病基因的下传。CN 102002527A公开了一种用于检测牛CD18基因D128G突变的引物和特异性的Taqman MGB探针，利用这些引物和探针，采用实时荧光定量PCR技术，能够快速灵敏地检测待测牛CD18基因D128G突变位点基因型，从而准确筛查BLAD遗传缺陷携带者。CN 100419088C公开了一种筛选⑶18基因正常的优良种牛的方法及其专用引物。其引物是由序列表中序列I和序列2的核苷酸序列组成的引物对。该方法是以待测牛的基因组DNA为模板，在由序列表中序列I和序列2的核苷酸序列所组成的引物对的引导下进行PCR扩增，检测扩增片段自5’端第32位碱基为A、G还是N，扩增片段自5’端第32位碱 基为A的种牛为⑶18基因正常的优良种牛；所述N为A和G的杂合体。CN 10189951IA公开了一种应用AS-PCR检测牛白细胞黏附缺陷的方法，其通过制备一种用于牛黏附缺陷检测方法的特异性PCR引物，所述引物包括CD18基因扩增引物突变型扩增引物长度为500bp ;引物I :5’ AAGATGACGAGGAGCAGAA 3’，引物2 :5’ GTCCATCAGGTAGTACAGGC 3’ ；野生型扩增产物长度为818bp ;引物3 :5 ’ CAAGGGCTACCCCATCGA 3 ’，引物 4 :5 ’ CAGGACTGCGTGGCTAAA 3 ’。该引物可直接应用于在体外开展牛黏附缺陷的致病基因的筛选。上述方法均为检测BLAD⑶18基因缺陷提供了选择，但各种方法之间缺乏统一的标准，为大规模的普查统计带来了难度，不利于开展大型的BLAD致病基因筛查。
技术实现思路
本专利技术目的在于，提供一种BLAD CD18野生型和突变型双基因型(A/G型)杂合子质粒及其构建方法，以便以该质粒作为标准质粒，在此基础上，能够建立起方便、高效且特异的检测BLAD的方法，进而为测定奶牛群中BLAD发生频率和BLAD检测试剂盒的研发奠定基础，使大规模BLAD致病基因的筛查成为可能，以此不仅可以掌握BLAD基因携带和发病情况，还可以排除隐性有害基因的携带者，避免和降低种公牛传播扩散有害基因的风险，最终为有效预防和治疗BLAD做出贡献。为达到上述目的，本专利技术采用如下技术方案一、构建BLAD⑶18基因标准野生型(A/A型)质粒采用如下步骤(I)以正常牛基因组DNA为模板，以上游引物F :5’ -ATTGATATCTGGTGCCTAGTCTCGCTTTT-3’，下游引物 R :5’ -AGGGGAA GATGGAGTAGCTG-3’ 建立起 50 μ L 的 PCR 反应体系，扩增BLAD⑶18野生基因型(Α/Α)目的片段。在O. 2mL的PCR管中加入2 μ L (50ng)的牛基因组 DNA、5y L 的 10XE*Taq buffer、4y L 的 dNTP (各 I. 5mM)、2y L 浓度为 10 μ M 的上游引物F、2 μ L浓度为10 μ M的下游引物R、0. 5 μ L的Taq E和35 μ L的灭菌去离子水，反应程序为94°C预变性5min，94°C变性30s、60°C退火30s、72°C延伸60s，40个循环。(2)步骤(I)的PCR产物经2%的琼脂糖凝胶电泳,经与标准DNA Marker条带比较，得到大小为1070bp的DNA片段，与引物所限定的目的片段大小一致。(3)用OMEGA公司的Gel extraction kit对步骤(I)的PCR产物进行切胶回收，步骤如下①将步骤(I)的PCR产物进行O. 8%的琼脂糖凝胶电泳；②在紫外透照台上将目的片段快速切下，放入已经称重的两个I. 5mL离心管中，然后称重，得出胶块的重量；③根据胶重按每毫克加一微升的量加入Binding Buffer,放55_60°C金属浴中加热直至胶完全溶解，期间每本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种BLAD？CD18野生型和突变型双基因型（A/G型）杂合子质粒，其特征在于，其是通过EcoRI酶切产生黏性末端后反向连接BLAD？CD18突变基因型（G/G）片段和野生基因型片段（A/A）的连接产物。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：贾广乐，周莉，廖娟红，林祥梅，
申请(专利权)人：中国检验检疫科学研究院，
类型：发明
国别省市：
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