本发明专利技术涉及植物基因工程技术领域。具体涉及包含水稻育性控制基因RAD51C的分离克隆、功能验证。RAD51C基因属于RecA/RAD51蛋白质家族，它能够控制水稻花粉以及胚囊的育性。敲除该基因使水稻减数分裂异常导致花粉不育和胚囊不育。可以通过组织特异性地抑制RAD51C基因表达创建雄性不育或者雌雄不育水稻材料。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及植物基因工程领域。具体涉及一个育性控制基因RAD51C的分离克隆和功能验证。RAD51C通过参与水稻减数分裂的调控，控制水稻花粉育性和胚囊育性。对该基因的生物学功能验证结果表明，该基因可以作为不育基因，用于水稻杂交种子生产和育性控制。
技术介绍
水稻生产在我国粮食生产上有着举足轻重的地位。自二十世纪七十年代以来，一系列杂交水稻的推广，使得单产有了大幅度提高，在一定程度上缓解了我国人口迅速增长对粮食的需求急剧增长的压力。杂交水稻选用在遗传上有一定差异的优良水稻品种，用三系法(不育系，保持系和恢复系)、一些衍生出来的两系法和一系法生产具有杂种优势的杂交种。杂种优势是两个遗传背景不同的亲本杂交产生的杂种一代在生长势，生活力，繁殖·力，产量等方面优于双亲的现象。三系法中，不育系是不能自花授粉结实的，主要为雌蕊发育正常，而雄蕊的发育退化或者败育。保持系的雌雄蕊都发育正常。将保持系的花粉授予不育系可以成功获得种子，但是由该种子产生的植株仍然为雄性不育。用恢复系的花粉授予不育系所产生的种子长出的植株又恢复了育性。雄性不育系的利用是制备杂交种的重要环节，但是从自然界寻找不育系并不多，而且选育雄性不育系和恢复系也存在一定的困难，利用基因工程的方法获得不育系和恢复系前景诱人。花粉发育是一个极其复杂的过程，需要多个基因按照一定的时空表达模式共同参与，才能顺利完成，任何一个过程出现异常都会导致花粉不育。通过基因工程的方法创造雄性不育系的途径包括(I)利用花药或者花粉特异的启动子表达细胞毒素基因，选择性破坏花粉发育的某些组织；(2)通过基因沉默可以阻断花粉发育相关基因的表达，导致花粉败育；(3)改变花粉发育过程中关键酶或者功能蛋白的时空表达可以获得雄性不育材料；(4)通过导入细胞质雄性不育基因或者扰乱线粒体功能创造细胞质雄性不育系等(缪颖等2000 ;宋江华等2008);对应雄性不育系的保持系可以是没有转化的对照植株，也可以是通过基因工程改造得到的保持系；另外，还可以通过无性繁殖来保持不育系。在真核生物的生活史中，要经历二倍体的孢子体时代和单倍体的配子体时代。在孢子体时代，真核生物进行减数分裂形成单倍体配子；来自父母本的雌雄配子发生融合使后代恢复到二倍体的水平。减数分裂在真核生物的有性生殖形成单倍体的过程中扮演着重要的角色，此过程中染色体出现的联会交换，大大增加了遗传的多样性。近十多年来，通过对模式生物酵母的减数分裂的研究，鉴定了许多控制减数分裂的基因。此外，人们通过反向或正向遗传学的方法在模式植物拟南芥中克隆了几十个控制减数分裂的基因(Schwarzacher, 2003 ；Ma, 2005 ；Mercier 和 Grelon, 2008)。比较酵母和植物的减数分裂发现，减数分裂的机制在真核生物中相对保守。真核生物的RAD51是一类与大肠杆菌(Escherichia coli)重组蛋白RecA结构和功能上很相似的蛋白，在有丝分裂和减数分裂过程中起到重要作用(Shinohara等，1992)。在对recA/RAD51基因家族的研究中发现RAD51基因家族由于基因重复和基因水平转移，而形成 RAD51，RAD51B, RAD51C, RAD51D, DMCl, XRCC2, XRCC3, RecA 等多个成员(Lin 等，2006)。真核生物酵母基因组中包含多个RecA和RAD51同源蛋白，而在哺乳动物中包含五个同源蛋白(RAD51B，RAD51C, RAD51D, XRCC2和XRCC3)，这些蛋白与RAD51或者相互之间有20%至30%的序列同源性(Lovett, 1994 ;Sonoda等,2001)。水稻中至少有13个同源蛋白，其中包括RAD51A1，RAD51A2, RAD51B, RAD51C, RAD51D, DMC1A, DMC1B, XRCC2, XRCC 3 以及四个 RecA 同源蛋白(http://rice, plantbiology. msu. edu/)。RAD51基因家族成员大多数在减数分裂中扮演重要角色，突变以后减数分裂可能会出现不同程度的异常。酵母DMCl基因是一个在减数分裂前期I表达的减数分裂特异基因，编码的蛋白是减数分裂同源染色体配对所必需的。在中国小鼠细胞系CL-V4B、irsUirslSF中，RAD51C, XRCC2和XRCC3突变后对DNA交联剂敏感，染色体自发异常频率明显增加(Cui等，1999 ;Godthelp等，2002)。小鼠RAD51B，RAD51D以及XRCC2突变后在胚胎发育阶段致死(Shu 等，1999 ;Deans 等，2000 ;Pittman 和 Schimenti，2000)。线虫 RAD51C，XRCC3 突变后减数分裂重组异常导致部分不育，并且对DNA双链损伤剂敏感(Abdu等，2003)。在拟南芥中，AtRAD51突变以后营养生长和有丝分裂没有明显的异常，而减数分裂受到严重的影响(Mercier等，2003)。在AtRAD51的突变体中，偶线期染色体不能正常的联会，无法形成联会复合体以及减数分裂前期I出现染色体断裂(Mercier等，2003)。AtRAD51C和AtXRCC3突变以后与AtRAD51的突变体有着类似的表型营养生长正常；减数分裂异常，不能形成正常的雌雄配子从而导致败育(Bleuyard等，2006)。AtRAD51B、AtRAD51D和AtXRCC2突变以后提高了对丝链霉素COnitomycin C)的敏感性，但减数分裂没有明显的异常(Bleuyard等,2005 ；Durrant等,2007)。AtDMCl突变以后减数分裂过程中不能形成二价体,但是可以修复双链断裂(Couteau等，1999)。玉米RAD51A1和RAD51A2参与同源染色体联会配对以及双链断裂修复过程，双突变体中能够看到非同源染色体的配对，联会和交换。水稻中有两个拷贝的DMCl，分别是DMClA和DMC1B，DMCl基因控制水稻细胞减数分裂过程中同源染色体的配对，该基因受抑制后营养生长正常，但是减数分裂过程中染色体进行不均等分离和孢子形成无规则，从而使花粉不育，结实率降低(Ding等,2001 ;Deng和Wang, 2007)。目前还没有关于水稻RAD51C基因的功能的报道。本专利技术利用RAD51C的T-DNA插入突变体详细研究了该基因在减数分裂过程中的作用，为植物育性的控制提供了新的途径，也为我们深入了解减数分裂的机制提供了帮助。
技术实现思路
本专利技术的目的是分离克隆一个控制水稻减数分裂的基因，涉及分离一种包含RAD51C基因的DNA片段，通过该片段的T-DNA插入突变体以及遗传互补鉴定表明该片段控制水稻减数分裂、影响雌雄配子的发育从而控制水稻的育性。该基因的克隆有利于了解水稻减数分裂的过程，并为人工控制水稻花粉育性或胚囊育性以生产杂交种子提供理论基础。其中，所述片段如序列表SEQ ID NO: I所示，或者基本上相当于SEQ ID N0:1所示的DNA序列，或者其功能相当于SEQ ID NO :1所示序列的亚片段。本专利技术的另一个目的是通过控制水稻减数分裂基因RAD51C的表达来获得不育转基因水稻，进而利用不育水稻生产杂交种，为增加水稻产量，本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种分离的RAD51C基因在控制水稻育性中的应用，其特征在于该基因的核苷酸序列如序列表SEQ？ID？NO：1所示。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王石平，寇艳君，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：
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