肝素酶Ⅲ的固定化方法技术

本发明专利技术涉及一种肝素酶Ⅲ的固定化方法，尤其涉及一种以壳聚糖微球为固定化材料，对肝素酶Ⅲ进行固定化的方法。肝素酶Ⅲ固定化以后具有可回收、可重复利用、酶与底物和产物易分离等优越性。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种肝素酶III的固定化方法，尤其涉及一种以壳聚糖为固定化材料对肝素酶III进行固定化的方法，实现肝素酶III的固定化和可重复利用性。
技术介绍
肝素酶是指一类能够特异性裂解肝素和类肝素主链糖苷键的酶，最初是从肝素黄杆菌中发现并分离出来的，其后又发现在一些微生物和动物组织中也有肝素酶存在。目前有学术论文报道的肝素酶大约有10多种，得到较为细致研究的只有来自肝素黄杆菌的3种酶，分别是肝素酶I (EC编号4. 2. 2. 7)、肝素酶II (无EC编号)、肝素酶IIKEC编号4.2. 2. 8)。肝素酶I、II、111分别是分子量大约43、78、66kd的单体蛋白质，其等电点均在9. O左右，应用和研究非常广泛。 肝素酶III是一种主要以硫酸乙酰肝素为催化降解底物的酶，只对肝素链上极少的特定位点具有催化裂解作用。肝素酶III对制备硫酸乙酰寡糖、研究肝素和硫酸乙酰肝素的结构有重要的作用。然而游离的肝素酶III在发生反应时需要将其加入底物中，反应以后酶溶液、底物和产物混合在一起不容易分离，导致酶无法重复使用，利用效率低下，这为应用带来很多不便，需要寻找一种能提高肝素酶III利用效率的方法。与游离酶相比，固定化酶在保持其高效专一及温和的酶催化反应特性的同时，又克服了游离酶的不足之处，具有分离回收容易、可多次重复使用、操作连续可控等一系列优点，因此，对肝素酶III的固定化是一种提高使用效果的理想选择。但目前对肝素酶III进行固定化的研究未见报道。经过长期研究，本专利技术的专利技术人发现了一种高效并且低成本的肝素酶III的固定化方法。籍此，本专利技术给出了一种以壳聚糖微球为材料对肝素酶III固定化的方法，成功实现了肝素酶III与底物和产物的分离，使酶的应用潜力更大。
技术实现思路
本专利技术提供了一种用壳聚糖微球固定肝素酶III的方法，包括下述步骤 (1)肝素酶III溶液的制备选择TriS-HCl缓冲液(pH7.0，其中含CaCl2)作为肝素酶III的溶剂，将肝素酶III溶解在该缓冲液中，制得肝素酶III溶液； (2)肝素酶III与壳聚糖微球的交联将壳聚糖微球用Tris-HCl缓冲液(pH7. 0，其中含IOmM CaCl2)充分溶胀，再取步骤(I)获得的肝素酶III溶液，将其加入该壳聚糖微球中，进行交联； (3)用乙酸-乙酸钠和Tris-HCl两种缓冲液分别洗涤上述交联后的壳聚糖微球至洗脱液无酶活性； (4)利用还原剂对步骤(3)中获得的固定了肝素酶III的壳聚糖微球进行处理，随后，如果需要，除去残余的还原剂，由此得到固定在壳聚糖微球上的肝素酶III。在上述实施方案中，优选步骤(I)中用于溶解肝素酶III的溶剂TriS-HCl的浓度为 10-50mM，其中含 CaCl2 浓度为 lO-lOOmM，最优选 50mM Tris-HCl (pH 7.0，其中含 IOmMCaCl2)； 在上述实施方案中，优选步骤(I)中肝素酶III在溶液中的浓度为O. l-100IU/ml，更优选为 1-10 IU/ml，最优选为 2-5 IU/ml。在上述实施方案中，步骤(2)中所述壳聚糖微球可以通过现有技术中已知的制备方法进行制备，例如，可以采用反相悬浮法进行制备，其中使用的交联剂可以由本领域技术人员适当选择，例如应用最为广泛的交联剂为戊二醛。所述溶胀时间可以根据溶胀程度由本领域技术人员进行控制，例如，溶胀20分钟。在上述实施方案中，优选步骤(2)中使用的壳聚糖微球与肝素酶III溶液的体积比为 1/10-10/1，更优选 1/5-5/1，最优选 1/2-2/10在上述实施方案中，优选在步骤(2)中，交联温度为4-10°C，交联时间为8-24h，更优选的交联温度为8-10°C，交联时间为12-20h。 在上述实施方案中，优选步骤(3)中使用的缓冲液为乙酸-乙酸钠缓冲液(pH6.0-8. 0)，更优选为50-150mM乙酸-乙酸钠(pH 6. 5-8. 0，其中含50_200mM NaCl)缓冲液，最优选为IOOmM乙酸-乙酸钠(pH 7. 5，其中含IOOmM NaCl)缓冲液。在上述实施方案中，优选步骤(3)中使用的缓冲液为Tris-HCl缓冲液，更优选为50mM Tris-HCl (pH 6. 5-8. 0，其中含 IO-IOOmM CaCl2 和 50_200mM NaCl)缓冲液，最优选为 50mM Tris-HCl (pH 7. 5，其中含 50mM CaCl2 和 IOOmM NaCl)缓冲液。在上述实施方案中，在步骤(4)的还原剂处理步骤中，是对壳聚糖上的氨基与戊二醛上的醛基共价交联后产生的不稳定C=N双键进行还原，该还原步骤中可以使用任何已知的可以用于还原该双键的还原剂，比如硼氢化物、氢化铝锂、雷尼镍等，优选硼氢化物，比如碱金属硼氢化物，例如硼氢化钠、硼氢化钾等。在上述实施方案中，优选步骤(4)中使用的NaBH4浓度为l-10mg/ml，反应0.5-10h ;最优选择浓度为l_5mg/ml的NaBH4,反应l_3h。在上述实施方案中，优选步骤(4)中使用Tris-HCl缓冲液冲洗除去剩余的还原剂，更优选该缓冲液为50mM Tris-HCl (pH 7.0，其中含IOmM CaCl2)0在上述实施方案中，在进行步骤(4 )之后，为了能够对该方法进行评价，获得固定化酶活与上样的游离酶活相比能够得出整个固定化过程的效率，以及对固定化酶进行定量，可以在进行还原剂处理步骤之后，测固定化酶活。在上述实施方案中，在获得固定化的肝素酶III之后，保存条件为保存在Tris-HCl缓冲体系中，pH 6. 5-8. 0，添加金属盐CaCl2和NaCl，保存温度为0_25°C，最优条件为保存在50mM Tris-HCl (pH 7. 5，其中含IOmM CaCl2),温度为4_10°C环境中。在使用时，该固定在载体上的酶可以和底物直接反应，反应完后经分离，固定在载体上的酶可以再次使用。固定化肝素酶可以应用于血液中肝素的清除，用于低分子肝素的生产制备，用于肝素和低分子肝素样品的部分或完全降解。在上述实施方案中，优选步骤(2)中的反相悬浮法为 取市售壳聚糖粉末溶于乙酸中，制得酸性壳聚糖溶胶，将分散剂加入油相中，然后将酸性壳聚糖溶胶加入油相中，乳化之后，加入戊二醛进行交联，交联完毕后加入等体积的NaOH和无水乙醇的混合液，搅拌后静置，弃去油层和水层，并用超纯水反复洗涤，即得壳聚糖微球。在上述实施方案中，用于溶解壳聚糖的溶剂为2%的乙酸溶液，壳聚糖的质量分数为2%。优选分散剂为Span 80，优选油相为液体石蜡，优选转速为500-800rpm ;优选的交联剂为25%的戊二醛，优选的交联时间为l_2h，优选的2. 5M NaOH与无水乙醇的体积比为.1/1。在上述实施方案中，优选使用的固定化肝素酶III测定方法为DMB法和 232nm 法。在最优选的实施方案中，本专利技术的肝素酶III的固定化方法包括下述步骤 (la)、壳聚糖微球的制备 取壳聚糖粉末溶于2%的乙酸中，制得酸性壳聚糖溶胶，将Span 80加入液体石蜡中，高速搅拌混合，将酸性壳聚糖溶胶逐滴加入液体石蜡中，乳化Ih后，加入戊二醛作为交联剂，交联温度为40°C，交联完毕后加本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种肝素酶Ⅲ的固定化方法，包括下述步骤：（1）肝素酶Ⅲ溶液的制备：选择Tris？HCl缓冲液（pH7.0，含CaCl2）作为肝素酶Ⅲ的溶剂，将肝素酶Ⅲ溶解在该缓冲液中，制得酶溶液；（2）肝素酶Ⅲ与壳聚糖微球的交联：将壳聚糖微球用Tris？HCl缓冲液（pH？7.0，？含10mM？CaCl2）充分溶胀，再取步骤（1）获得的肝素酶Ⅲ溶液？，将其加入该壳聚糖微球中，进行交联；（3）用乙酸？乙酸钠（pH？6.5？8.0，含NaCl）和Tris？HCl（pH？6.5？8.0，含CaCl2和NaCl）两种缓冲液分别洗涤上述交联后的壳聚糖微球，至洗脱液无酶活性；（4）利用还原剂处理步骤（3）中获得的固定了肝素酶Ⅲ的壳聚糖微球，随后，如果需要，除去残余的还原剂，由此得到固定在壳聚糖微球上的肝素酶Ⅲ。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：马小来，白佳珂，史绍鹏，李锂，
申请(专利权)人：深圳市海普瑞药业股份有限公司，
类型：发明
国别省市：