本发明专利技术涉及一种重组CCR5Δ32/Δ32基因型胚胎干细胞株，本发明专利技术还涉及所述干细胞株的制备方法。本发明专利技术利用同源重组技术直接对人胚胎干细胞的CCR5基因的32个碱基进行定点删除改造，建立了具有永生性的CCR5Δ32/Δ32基因型灵长类动物胚胎干细胞株。所得到的细胞株在被定向诱导分化为CD4阳性细胞后，既能抵御病毒的侵入，又保留了CCR5的其它功能，为治疗艾滋病提供了一种新途径。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种重组CCR5 Δ 32/ Δ 32基因型胚胎干细胞株，本专利技术还涉及采用同源基因重组技术获得所述干细胞株的方法。
技术介绍
CCR5是T细胞表面与艾滋病毒结合的联合受体之一，研究人员们一直在寻找改变或破坏CCR5受体功能的方法，希望达到治疗艾滋病的目的。有人利用锌指核酸酶破坏造血干细胞的 CCR5 基因表达(Nathalia Holt et al. Human hematopoietic stem/progenitorcells modified by zinc-finger nucleases targeted to CCR5control HIV-Iin vivo.Nat Biotechnology28(8) :839_47，2010.)，使CCR5基因发生突变。但此方法的缺点是造成T细胞的CCR5基因完全失活状态，不能保留CCR5的其它功能。而且，这种CCR5基因失活的细胞不具备永生性。 已发现CCR5A32/A32基因型的人群对艾滋病具有天然的免疫力。文献(Hutter, G. etal. Long-term control of HIV by CCR5Delta32/Delta32stem celltransplantation. N Engl JMed 360 :692-698,2009)报道用带有天然缺失 32 碱基的 CCR5基因的骨髓成功治愈了一例既有白血病又有艾滋病的患者。CCR5A32是指该基因缺失32个碱基的突变型，由于此突变导致艾滋病毒无法与T细胞结合从而无法攻击T细胞产生免疫缺陷。遗憾的是，尽管自然界本身存在这种基因型，真正处于纯合状态(CCR5 Λ 32/Λ 32)的这种基因型并对艾滋病具有天然免疫力的个体极少，在欧洲人群中仅占I %，而在亚洲和其他人种至今未见报道。因此，想要利用他们的骨髓或脐带血来治疗艾滋病基本不具备可能性和实用性。况且，不论是骨髓或是脐带血，都无法在体外扩增，更是增加了其独有的稀缺性。而人为定点删除CCR5中32个碱基的CCR5 Δ 32/ Δ 32的并具有永生性的细胞株，至今尚未见报道。大肠杆菌同源重组是20世纪90年代末发展起来的一种新的基因工程技术，最初是在大肠杆菌Escherichia coli里进行的,它可以不必依赖限制性酶切位点而定点精确地完成诸如片段插入、删除及序列改变等等基因改造。大肠杆菌同源重组技术常用于染色体DNA的靶向修饰-基因敲入与敲除，以及空隙修复(gap-r印air)方式获取目的基因。二者共同之处是都必须以PCR方法合成两侧50-70bp的短同源序列，然后通过细菌内同源重组将短同源序列间的片段插入基因的目标位置或套取相应的基因目标片段。由此可见，利用该项技术可以在大肠杆菌体内方便地进行DNA靶序列的敲除、敲入、克隆、突变等多种遗传工程操作。结合目前飞速发展的胚胎干细胞(ES)技术使得在生物整体水平上定向改变和修饰哺乳类动物的遗传物质称为可能。虽然基因打靶技术应用于改造胚胎干细胞基因较早，但由于以前打靶载体多为利用限制性酶切技术构建打靶载体，由于酶切位点的局限性打靶载体的同源臂长度受到限制，从而使得胚胎干细胞的基因同源重组成功率极低。而最近利用细菌内同源重组技术在BACDNA的基础上可以构建出足够长的同源臂的打靶载体，因此可以较大地提高胚胎干细胞基因打革巴的效率(Song et al. Modeling disease in human ESCs using an efficientBAC-based homologous recombination system. Cell Stem Cell,6 :80-89,2010)。综上，如果能利用同源基因重组技术手段，定点删除CCR5的32个碱基，得到CCR5 Δ 32，建立一种处于纯和状态CCR5 Δ 32/ Δ 32基因型的永生性细胞株。这种永生性细胞株，在适当的条件下，可以定向分化为所需要的细胞(如CD4阳性细胞)，既能抵御特定病毒的侵入，同时又保留了 CCR5的其它功能。并且，这种过程可以无限重复。因此，建立永生性的CCR5 Δ 32/ Δ 32基因型胚胎干细胞株具有重大意义。
技术实现思路
本专利技术的目的是对胚胎干细胞的CCR5基因的32个碱基进行定点删除改造，建立 具有永生性的CCR5 Δ 32/ Δ 32基因型灵长目动物胚胎干细胞株。所得到的细胞株在被定向诱导分化为CD4阳性细胞后，既能抵御特定病毒的侵入，又保留了 CCR5的其它功能，且具有永生性。本专利技术的另一目的是利用同源重组技术制备上述细胞株。本专利技术对人胚胎干细胞的CCR5基因的32个碱基进行定点删除改造，建立了具有永生性的CCR5 Δ 32/ Δ 32基因型胚胎干细胞株，达到了上述专利技术目的。因此，本专利技术提供了一种其CCR5基因特定位点缺失了 32对碱基；所述特定位点是 3321-3352，S卩 TATCAATTCTGGAAGAAITTCCAGACATTAAA (CCR5 基因号 NG 012637. 1，位于3ρ21· 31)。本专利技术在基因打靶hES的过程中确认CCR5 Δ 32/ Δ 32基因型(见实施例)。本专利技术根据多项人胚胎干细胞株常用鉴定实验(多能基因的表达、拟胚体形成、畸胎瘤形成及核型分析)证明经过基因改造后的人胚胎干细胞株仍然保留了人胚胎干细胞的特征活性，即，该细胞株具有分化成CD4阳性T细胞的能力。T细胞表面标志为CD3阳性，为HIV病毒侵袭感染的T细胞亚型为⑶4阳性。如果CCR5 Λ 32/ Λ 32基因型hES细胞株在体外诱导分化成CD4阳性T细胞，可以通过抗CD3、CD4抗体进行免疫组化实验和流式细胞术鉴定，当实验结果表明分化细胞为CD3、CD4双阳性时即证明该细胞株具有分化成CD4阳性T细胞的能力。本专利技术所得到的CCR5 Δ 32/ Δ 32基因型人胚胎干细胞株，经定向分化为骨髓造血干细胞(或CD4阳性细胞)后，即可作为细胞性药物，直接用于HIV病毒的基因治疗。由于人胚胎干细胞具有全能性，可以在体外特定条件下分化成人体各种组织细胞包括CD4阳性T细胞；同时人胚胎干细胞具有干细胞特性，可以在体外无限增殖扩增。因此，本专利技术所获得的CCR5 Δ 32/ Δ 32基因型人胚胎干细胞株是一种特殊的人胚胎干细胞株，既能无限扩增殖，又具有多向分化潜能。将其定向分化为骨髓干细胞(或CD4阳性细胞)时，可用于艾滋病的治疗。由于CCR5参与了机体的免疫功能，当发生Λ 32突变时，仅导致病毒不能侵入，而对其它功能基本不受影响，而且由于胚胎干细胞的永生性和无限扩增能力，使得这种过程得以无限重复，具有很强的实用性，为治疗艾滋病提供了一种新途径。另一方面，本专利技术还提供了一种采用同源重组技术获得CCR5 Δ 32/ Δ 32基因型胚胎干细胞株的方法。本方法的主要技术手段是采用BAC DAN和大肠杆菌内同源重组技术构建打靶载体，电转入胚胎干细胞后改造CCR5基因。具体方法是采用BAC DAN和大肠杆菌内同源重组技 术构建打靶载体，电转化胚胎干细胞后改造CCR5基因。所述构建打靶载体是构建两个带有正负筛选PNS标记的中间打靶载体和一个无筛选标志的CCR5A32打靶载体，通过标记和置换两步打靶法获得一本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种灵长目动物的CCR5Δ32/Δ32基因型细胞株，其特征是CCR5基因位于3321～3352位点的32对碱基缺失。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：李东升，曾毅，卢智勇，滕智平，
申请(专利权)人：武汉丹弥优生物医药有限公司，
类型：发明
国别省市：
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