本发明专利技术涉及一种肺炎衣原体基因工程表达人工抗原；制备该抗原的方法，该方法包括包括PCR克隆扩增肺炎衣原体MOMP抗原基因序列，构建原核表达载体，大肠杆菌表达肺炎衣原体MOMP抗原蛋白，采用透析法、梯度稀释法、和凝胶层析法复性包涵体，获得具有三维结构和免疫活性的重组肺炎衣原体MOMP抗原；一种检测肺炎衣原体抗体快速检测方法，该方法包括应用肺炎衣原体抗原；一种用于肺炎衣原体抗体检测的快速检测试剂，该试剂包含肺炎衣原体抗原。根据本发明专利技术，提供了一种肺炎衣原体抗原，该抗原具有高度的特异性。本发明专利技术提供了制备该抗原的方法，快速测定肺炎衣原体抗体的方法，以及用于快速测定肺炎衣原体抗体的试剂。
【技术实现步骤摘要】
,制备该抗原的方法,利用该抗原检测抗肺炎衣原体抗体的快速检测 ...的制作方法
本专利技术涉及一种用于诊断肺炎衣原体感染的肺炎衣原体抗原，制备该抗原的方法，用该抗原测定抗肺炎衣原体抗体的方法及试剂。本专利技术在由肺炎衣原体引起的非典型肺炎的诊断中有重要意义。
技术介绍
衣原体是一种革兰阴性、专性寄生于细胞内的寄生物。可在人肺泡巨噬细胞、上皮细胞、内皮细胞、平滑肌细胞、中性粒细胞中繁殖。它的生长具有独特的周期，位于细胞外的衣原体原生小体(EB)别摄取到细胞内形成包涵体，然后转化成网状小体(RB) ,RB具有繁殖 能力，但不具备感染能力。在细胞内繁殖的RB很快转化为EB，穿破包涵体和细胞壁到达细胞外。EB没有繁殖能力，但具有感染能力。目前，已证实有四种衣原体，即沙眼衣原体、鹦鹉热衣原体、猫心衣原体和肺炎衣原体，其中肺炎衣原体可以通过空气传播感染人类。肺炎衣原体(Chlamydia pneumoniae,Cpn)是人类呼吸道疾病的重要病原体,主要引起人的非典型性肺炎、支气管炎、鼻窦炎等呼吸道疾病。另外，流行病学和病原学研究认为，肺炎衣原体感染与心血管疾病相关。Cpn经飞沫或呼吸道分泌物传播，可在家庭和集体场所相互感染。肺炎衣原体由于其独特的寄生和抗原特性，常对人体造成直接或间接的危害，Cpn以被列为对中国人卫生健康有重大影响的病原微生物之一。肺炎衣原体感染所致的临床症状较轻，常被人们忽视，往往需要特异性的实验室检测才能被发现。另外临床依据患者的症状和体征，很难鉴别细菌性、病毒性、肺炎支原体或肺炎衣原体的感染，以致在临床用药上存在困难，实验室检测有助于其鉴别诊断。微生物感染症的实验室检测主要包括对感染部位等处的病原菌的检测和对患者血清、体液中病原菌的抗体检测两种方法。病原菌的检测包括病原菌分离培养、病原菌特异抗原检测和基因检测等方法。虽然培养法是肺炎衣原体实验室诊断的“金标准”，但肺炎衣原体是严格的细胞内寄生，培养条件要求苛刻，检测灵敏度低，临床适用性不强。以聚合酶链式反应(PCR)为代表的基因检测技术虽然具有较高的特异性和敏感性，但其准确性易受实验条件和操作人员技术水平的影响。抗体检测是肺炎衣原体感染较理想的实验室检测方法之一。Wang和Graystong早在1971年建立了的间接微量荧光实验(微量IF)，微量IF实验需要纯化的衣原体EB，而且要求EB的形态或结构完整，不能使用形态或结构改变或破坏的EB。由于EB具有感染力和毒性，使用完整的的EB作抗原有潜在的传染性，再加IF实验步骤复杂，微量IF实验在临床检验中很少使用。随后建立的肺炎衣原体抗体酶联免疫吸附法(ELISA)具有检测过程简单、高通量检测等特点，大多数试剂都使用完整的衣原体EB作抗原，但衣原体EB抗原可引起非特异性反应。衣原体的代表性属特异性抗原为脂多糖(LPS)，它与某些肠道菌Re突变体LPS有共同抗原，是肺炎衣原体的致病物质，是一种细胞壁成分——内毒素，其毒性作用可被特异性抗体中和。衣原体种特异性的抗原是其主要外膜蛋白(MOMP)，约占衣原体外膜蛋白的60%，分子量约为39. 5kDa，与肺炎衣原体外膜结构的稳定性、生长代谢调节、抗原性和毒力性密切相关，是人类特异性体液免疫反应的主要靶位。除MOMP外衣原体其他主要外膜抗原以属特异性为主，但也存在一些种特异性，如分子量为40kDa D外膜抗原是属特异性，分子量为43k Da、46kDa和53kDa的蛋白质是种特异性抗原，还有一种分子量为98kDa的大分子蛋白可能是种特异性抗原。如上所述，衣原体的抗原性很复杂，同属的衣原体在不同种间其抗原性也存在着明显的差异。感染有肺炎衣原体的个体所产生的肺炎衣原体抗体同样表现出与其抗原复杂性相一致的多样性。因次，应用衣原体EB菌体作检测抗原或纯度不高EB来源的纯化抗原均可产生非特异性反应。另外，虽然已建立了肺炎衣原体抗体检测方法，但它们无法达到肺炎衣原体快速检测的临床需求。因此，制备一种特异性强、检测敏感度高的肺炎衣原体抗原及一种简单、高效生产肺炎衣原体抗原的方法，有利于建立更高效的肺炎衣原体诊断方法、提高肺炎衣原体诊断水平。
技术实现思路
本专利技术的第一目的是提供一种肺炎衣原体种特异性抗原，该抗原具有高度的种特异性和免疫反应性。本专利技术的第二目的是提供一种制备肺炎衣原体抗原的方法，该方法制备的肺炎衣原体抗原具有种特异性和免疫反应性。本专利技术的第三目的是提供一种测定抗肺炎衣原体抗体的方法，该方法为快速“一步检测法”，具有灵敏度高、特异性强，检测速度快、操作简便，无需专门设备，适用于临床检测、流行病学调查和场地检疫等多种场合。本专利技术的第四目的是提供一种肺炎衣原体抗体快速检测试剂，它是一种特异性强、灵敏度高、快速、简便的“一步法”肺炎衣原体抗体检测试剂。本专利技术的主要内容(I)肺炎衣原体抗原，它是一种采用基因工程技术人工合成抗原。(2)上面(I)中肺炎衣原体抗原，它与沙眼衣原体抗体和鹦鹉热衣原体抗体不发生非特异性交叉反应。(3) 一种制备肺炎衣原体抗原的方法，包括PCR克隆扩增肺炎衣原体MOMP抗原基因序列，构建原核表达载体，大肠杆菌表达肺炎衣原体MOMP抗原蛋白，采用透析法、梯度稀释法和凝胶层析法复性包涵体，获得具有三维结构和免疫活性的重组肺炎衣原体MOMP抗原。(4) 一种肺炎衣原体抗体快速检测方法，包括应用上面(1)-(2)种的肺炎衣原体抗原。(5)上面(4)中肺炎衣原体抗体快速检测方法，包括(1)-(2)种的肺炎衣原体抗原固定到一种硝酸纤维素膜，一种标记抗体(二抗)固定到固相载体上，待测样品与标记抗体(二抗)接触，若待测样品中存在肺炎衣原体抗体，则肺炎衣原体抗体与标记二抗反应形成抗体一标记二抗复合物，“复合物”在硝酸纤维素膜水平移动，遇到固定到膜上的肺炎衣原体抗原产生反应，带有标记物的“复合物”就被特异地固定到抗原上，固定抗原的位置就会有显色反应若待测样品不含肺炎衣原体抗体，则“复合物”不能固定到抗原的位置上，此处就没有显色反应，可依据硝酸纤维素膜上固定抗原位置是否有显色反应，来判断检测结果，即待测样品中是否有肺炎衣原体抗体。(6)上面(5)检测肺炎衣原体抗体检测方法，其中待测样品是人的血清、血浆或全血。(7)上面(5)或￠)中测定肺炎衣原体抗体检测的方法，其中的标记抗体(二抗)是标记的抗人IgG抗体或抗人IgM抗体。 (8)上述(5)-(7)中标记抗体是胶体金或彩色胶乳标记的抗体。(9) 一种快速检测肺炎衣原体抗体的试剂，它所用抗原为上述(1)-(2)中的肺炎衣原体抗原。(10)上述(9)中用于快速检测肺炎衣原体抗体的试剂，其中的标记抗体是胶体金标记抗体或彩色胶乳标记抗体。下面对本专利技术进行详细阐述。本专利技术的肺炎衣原体抗原是一种通过基因工程技术获得的重组肺炎衣原体主要外膜蛋白(MOMP)。本专利技术肺炎衣原体抗原，主要通过将肺炎衣原体主要外膜蛋白(MOMP)基因构建到原核表达载体PET，MOMP基因-PET表达载体转化大肠杆菌，筛选阳性重组菌，IPTG诱导重组菌表达肺炎衣原体MOMP蛋白，经细菌裂解、包涵体溶解和重组蛋白结构复性与纯化等步骤获得。 下面将详述本专利技术中制备肺炎衣原体抗原的方法。从基因BANK获取肺炎衣原体MOMP基因序列，根据已知的肺炎衣原体MOMP本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种肺炎衣原体抗原，它是一种采用基因工程技术人工合成抗原。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：李克生，杜慧芬，周海飞，
申请(专利权)人：李克生，
类型：发明
国别省市：
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