本发明专利技术属于医学领域，特别涉及心力衰竭的诊断技术，具体为氨基末端脑钠肽的B细胞表位肽段，氨基酸序列如SEQ?ID?NO：4或SEQ?ID?NO：5所示，其制备的特异性抗体可用于作为心力衰竭的诊断试剂；本发明专利技术制备的氨基末端脑钠肽是高纯度的氨基末端脑钠肽单体重组蛋白，该蛋白可用于抗体制备的免疫原及筛选原，同时可以作为建立氨基末端脑钠肽定量检测时的校准品。通过氨基末端脑钠肽蛋白序列的B细胞表位肽段免疫小鼠制备的单克隆抗体具有纯度高(SDS-PAGE检测纯度＞96％)、效价高(ELISA效价达1∶512000)、特异性好、可大批量制备等优点。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于医学领域，特别涉及心力衰竭的诊断技术。
技术介绍
心血管疾病是严重威胁人类生命和健康的重要疾病。其中，心力衰竭(HeartFailure, HF)作为严重危害人类健康的心血管疾病中的一种病理综合症，已不再被简单地看作是独立临床疾病，而是作为心血管疾病发展到后期的一个阶段，即从始发危险因子(高血压、高胆固醇血症、糖尿病)到左心室肥大、心肌细胞功能紊乱、冠心病、最后发展成为心力衰竭。有学者统计，心力衰竭患者一旦出现典型症状，5年存活率男性为25%，女性为38%，与恶性肿瘤病人相仿。2003年，中国心血管健康多中心合作研究组应用四阶段整群随机抽样方法，在中国10省市抽样调查，结果显示心衰患病率为O. 9%，随着年龄增高，心衰患病率显著上升。由于我国冠心病和高血压发病仍呈上升趋势，人口老龄化趋势明显， HF正成为我国心血管领域的重要公共卫生问题。在发达国家，约有7%的人群患有此病，目前也仅有2%的人被及时确诊。心力衰竭是大多数心血管疾病的最终归宿和最主要的死亡原因之一，呼吸困难是充血性心力衰竭(CHF)的主要症状，又是某些肺部疾病的主要临床表现，相互间鉴别比较困难，而在急诊工作中须在短时间内对呼吸困难做出正确诊断，因此，寻找一种敏感、快捷、准确的鉴别诊断方法对于急诊科医生来说是非常重要的，可以在很大程度上方便急诊科医生提高诊断的敏感性和特异性，并帮助判断病情的严重程度。或者在尚未出现明显“充血性”症状之前就着手干预治疗，从根本上防治HF，延缓HF发展进程，提高患者的远期存活率。从这个意义上来看，心力衰竭的早期诊断和治疗监测非常重要。然而，无论是在住院病人还是门诊病人，临床上用常规方法不但对HF的诊断方面存在困难，而且在分析治疗的结果时也不确定。如传统的心电图、超声心动图等检查方式，特异性和及时性都不够，而且传统的检查方式均不能对心肌损伤的长期影响进行评估，难以及时方便地指导患者的治疗。1988年日本学者Sudoh T等从猪脑内首次分离出一种与心房钠尿肽(Atrialnatriuretic peptide, ANP)功能相似的物质，即具有扩张血管、拮抗肾素-血管紧张素-醛固醇系统、抑制交感神经活性和促进尿钠排泄作用，虽然这一物质与ANP的分子结构相似，但其氨基酸组成和组织学分布存在差异，故将其命名为脑钠尿肽(Brain natriureticpeptide, BNP) 0目前，大量的研究已明确BNP是从其氨基酸前体蛋白(ρι·0-ΒΝΡ)中的羧基端裂解而来，是由心室细胞合成并分泌进入血液的32个氨基酸多肽，裂解同时产生76个氨基酸的无生物学活性的氨基末端脑钠肽(ΝΤ-ρι·οΒΝΡ)，二者来源相同并且等摩尔分泌。通过组织生理学研究发现，牵拉刺激、激素(如儿茶酚胺、血管紧张素、内皮素)分泌以及缺氧均能导致心肌细胞、心脏成纤维细胞分泌proBNP。从理论上讲，无论是检测BNP还是NT-proBNP,都可以反映体内心肌细胞受到的容量负荷和压力负荷的大小，均能够单独地预示左心室(LV)舒张末期压力增高的状况，能应用于充血性心力衰竭等相关疾病的鉴别诊断、疗效监测及预后评估。ΒΝΡ、ΝΤ-ρι·οΒΝΡ检测与肌钙蛋白、CK-MB和肌红蛋白不同，后三者是由于心脏损伤而释放的标志物，而血浆ΝΤ-ρι·οΒΝΡ水平在心脏功能代偿阶段即可明显升高，有利于更早发现心功能的异常。研究发现，BNP具有分子内的二硫键并且作为一种分析物不很稳定，其原因是由于BNP作为激素发挥生理功能，因而必须被迅速分解灭活。因此，它作为一种诊断标记的应用仅仅是有限的。而且BNP在血浆中含量较低，仅为7ng/L，而NT-pix)BNP的血浆含量平均值为41ng/L，后者对于区分健康个体和患有心力衰竭的患者，以及根据心力衰竭的严重程度对患者样本进行分级所需要的检测低限是足够的，可保证自动化实验室的样品常规测试得以实施。另外，NT-proBNP在血浆中的半衰期为120分钟，BNP的半衰期为22分钟，提示NT-proBNP更易进行免疫定量分析。目前认为，NT-proBNP成为检测HF的标准主要体现在以下几个方面①诊断症状性心力衰竭，用于急性呼吸困难的鉴别诊断；②诊断无症状性左室功能障碍，早期发现心衰病人判断心衰病人的危险分层，以判断是该入院还是出院检验心力衰竭的治疗·评估心力衰竭病人的预后评估急性冠脉综合征(ACS);⑦筛选慢性心衰高危人群；⑧作为猝死的标志物诊断舒张功能不全。罗氏诊断试剂公司(Roche Diagnostics, Inc)在美国和欧洲16个医学中心对2000多位健康和病患男女进行的临床研究，此项研究显示充血性心力衰竭症状的严重性与NT-proBNP的水平有关。2002年，国际上已经公认NT-proBNP是测定心衰的一个划时代的具有特异性的标志物。早期实验的研究对象多是急诊室呼吸困难、肺心病、心脏病患者，显示ΝΤ-ρι·οΒΝΡ与心衰具有很好的相关性，阳性预测值达到90% -95%，其阴性预测能力更具有价值。当急性心力衰竭出现左室充盈压增加的临床综合征以及如缺血、肺栓塞等任何导致肌细胞伸展的情形，检测ΝΤ-ρι·οΒΝΡ非常有益，同时对于鉴别呼吸困难是否为心源性原因具有重要意义，优于临床判断。另外，ΝΤ-ρι·οΒΝΡ还能辅助判断进展期心衰患者的预后，以及对左心室功能不全的治疗进行监测和指导。目前，基于NT-proBNP的心力衰竭试剂盒，仅有罗氏公司持有。灵敏度更高或成本更低的相关试剂盒急需开发。
技术实现思路
本专利技术的目的之一在于提供氨基末端脑钠肽B细胞表位肽段，其能作为氨基末端脑钠肽单克隆抗体的抗原。为实现上述技术目的，本专利技术的技术方案为氨基末端脑钠肽B细胞表位肽段，所述氨基末端脑钠肽B细胞表位肽段的氨基酸序列如SEQ ID NO :4或SEQ ID NO :5所示。上述氨基酸序列是通过如下手段获取的从NCBI Protein数据库中获取如SEQ ID NO :5所示的氨基末端脑钠肽蛋白序列；分别对氨基末端脑钠肽的蛋白的二级结构、抗原性、亲疏水性、可及性、柔韧性以及可能的糖基化位点，对各区段进行分析评分，选取得分高的区域作为B细胞表位区域，其序列如SEQ ID NO4 或 SEQ ID N0:5 所示。所述的B细胞表位肽段化学合成中在其N端引入半胱氨酸，以提高其与BSA的交联能力，接着与BSA或KLH交联。将所述的B细胞表位肽段与载体蛋白BSA或KLH交联之后，不仅能增加抗原的大小，也能增强免疫性。本专利技术的目的之二在于提供一种杂交瘤细胞，其能特异性的分泌氨基末端脑钠肽的单克隆抗体。为实现上述目的，本专利技术的技术方案为所述的氨基末端脑钠肽的B细胞表位肽段制备的杂交瘤细胞。杂交瘤细胞的制备是通过所述氨基末端脑钠肽的B细胞表位肽段与BSA或KLH交联后免疫Balb/c小鼠，取免疫后的小鼠脾细胞悬液并制备SP2/0细胞悬液(脾脏B淋巴细胞)，并与骨髓瘤细胞和融合，将融合细胞选择性培养，通过ELISA筛选后得到的杂交瘤细胞。将筛选出的最强阳性细胞进行克隆化培养，同时在克隆化培养的杂交瘤细胞中筛选出最强阳性化的杂交瘤细胞送于并送中国典型培养物保藏中心 (武汉大学保藏中心)保藏，保藏号为CCTCC NO C201288,其可稳定分泌所述单本文档来自技高网...
【技术保护点】
氨基末端脑钠肽的B细胞表位肽段，其特征在于：所述氨基末端脑钠肽的B细胞表位肽段的氨基酸序列如SEQ？ID？NO：4或SEQ？ID？NO：5所示。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：黄洪涛，石延宾，姚静，张宪，胡伟，魏勇，
申请(专利权)人：重庆业为基生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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