木聚糖酶变体及编码其的多核苷酸制造技术

本发明专利技术涉及亲本木聚糖酶的变体。本发明专利技术还涉及编码所述变体的多核苷酸；包含所述多核苷酸的核酸构建体、载体和宿主细胞；和使用所述变体的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及木聚糖酶的变体，编码所述变体的多核苷酸，产生所述变体的方法和使用所述变体的方法。
技术介绍
木聚糖，植物半纤维素的一种主要成分，是D-木糖通过β -I, 4-木糖苷键连接的聚合物。木聚糖可通过酸或酶水解降解为木糖和木糖寡聚物。木聚糖的酶水解产生游离糖，而不产生用酸形成的副产物(例如呋喃)。木聚糖酶可用于多种用途，如酶降解农业废物以供产生醇燃料，酶处理动物饲料以释放游离糖，酶处理以供在纤维素的制备中溶解纸浆(pulp)，以及在纸浆的生物漂白中的酶处理。具体而言，木聚糖酶可用于纸和纸浆工业以增强漂白的纸浆的亮度，改善纸浆的品质，减少化学纸浆漂白步骤中使用的氯的量，以及增加回收纸工艺中纸浆的游离度(freeness)。Dumon 等，2008，Journal of Biological Chemistry 283:22557-22564 描述了将超热稳定性工程改造入GHll木聚糖酶。Wang和Tao, 2008, Biotechnology Letters30:937-944公开了通过定向进化增强Thermobifida fusca木聚糖酶A的活性和碱性pH稳定性。美国专利号5，759，840公开了修饰家族11木聚糖酶以改善嗜热性、嗜碱性和热稳定性。美国专利号7，060，482公开了修饰的木聚糖酶，其包含在对应于里氏木霉(Trichoderma reesei)木聚糖酶(TrX)氨基酸序列的位置162处,或在其它木聚糖酶分子中的其等同位置处的碱性氨基酸，至少一个二硫桥，或其组合。美国专利号7，314，743公开了修饰的木聚糖酶，其具有在对应于里氏木霉木聚糖酶II氨基酸序列的位置处的至少一个取代的氨基酸残基。W02007/115391公开了修饰的家族11木聚糖酶，其包含在对应于里氏木霉木聚糖酶II氨基酸序列的位置99和118处的半胱氨酸残基以形成分子内二硫键。本专利技术提供了与其亲本酶相比具有改善的特性的木聚糖酶的变体。
技术实现思路
本专利技术涉及亲本木聚糖酶的分离的变体，其在一个或多个(几个)对应于SEQ IDN0:2 或 SEQ ID NO:4 的成熟多肽的位置 2，17，21，28，38，41，55，56，57，60，62，74，81，104，111，121，151，159，161，183，186，188，和192的位置处包含取代，其中所述变体具有木聚糖酶活性。本专利技术还涉及编码所述变体的分离的多核苷酸；包含所述多核苷酸的核酸构建体、载体和宿主细胞；和产生所述变体的方法。本专利技术进一步涉及降解含木聚糖材料的方法，其包括用此种变体处理所述材料。本专利技术还涉及处理纸浆的方法，其包括将纸浆与此种变体相接触。本专利技术进一步涉及降解含木聚糖材料的方法，其包括用此种变体处理所述材料。本专利技术进一步涉及产生木糖的方法，其包括将含木聚糖材料与此种变体相接触。附图说明图I显示质粒pTH025的限制性图。图2显示质粒pTH153的限制性图。 图3显示一个合成多核苷酸片段的DNA序列和推导的氨基酸序列，所述片段包含克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)丝氨酸蛋白酶核糖体结合位点(PBS)和与582bp的编码去除纤维素结合域的T. fusca GHll木聚糖酶的密码子优化的基因融合的克劳氏芽孢杆菌丝氨酸蛋白酶信号序列(下划线表示)。图4A和4B显示T. fusca木聚糖酶变体136的分光光度法和kappa数测量与野生型T. fusca GHll木聚糖酶在70。。和pH 9. 5的比较。图5A和5B显示T. fusca木聚糖酶变体370的分光光度法和kappa数测量与野生型T. fusca GHll木聚糖酶在70。。和pH 9. 5的比较。图6A和6B显示T. fusca木聚糖酶变体566的分光光度法和kappa数测量与野生型T. fusca GHll木聚糖酶在80。。和pH 9. 5的比较。图7A和7B显示T. fusca木聚糖酶变体564的分光光度法和kappa数测量与野生型T. fusca GHll木聚糖酶在80。。和pH 9. 5的比较。定义木聚糖酶活性术语“木聚糖酶”在本文中定义为催化木聚糖中1，4-β-D-木糖苷键的内水解的1，4-β -D-木聚糖-木聚糖水解酶(E. C. 3. 2. I. 8)。就本专利技术而言，木聚糖酶活性用 O. 1%AZCL_木聚糖燕麦(Megazyme Wicklow, Ireland)作为底物在 O. 01%TWEEN 20-125mM硼酸钠pH 8. 8中在50°C在595nm确定。变体术语“变体”意指具有木聚糖酶活性的多肽，其在一个或多个位置包含一个或多个(例如几个)氨基酸残基的改变，即取代、插入和/或缺失。取代意指用不同的氨基酸替代占据某位置的氨基酸；缺失意指去除占据某位置的氨基酸；而插入意指邻接于占据某位置的氨基酸添加1-3个氨基酸。突变体术语“突变体”意指编码变体的多核苷酸。野生型术语“野生型”木聚糖酶意指由天然存在的微生物，如见于自然界的细菌、酵母或丝状真菌表达的木聚糖酶。亲本或亲本木聚糖酶术语“亲本”或“亲本木聚糖酶”意指对其进行了改变以产生本专利技术的酶变体的木聚糖酶。所述亲本可为天然存在的(野生型)多肽或其变体。分离的或纯化的术语“分离的”和“纯化的”意指从与其天然相关的至少一种组分移出的多肽或多核苷酸。例如，如通过SDS-PAGE测定的，变体可为至少1%纯，例如至少5%纯，至少10%纯，至少20%纯，至少40%纯，至少60%纯，至少80%纯，至少90%纯，和至少95%纯；而多核苷酸如通过琼脂糖电泳测定的，可为至少1%纯，例如至少5%纯，至少10%纯，至少20%纯，至少40%纯，至少60%纯，至少80%纯，至少90%纯，和至少95%纯。成熟多肽术语“成熟多肽”意指以其在翻译和任何翻译后修饰之后的最终形式存在的多肽，所述修饰例如N-末端加工、C-末端截短、糖基化、磷酸化等。在一个方面，根据预测SEQ ID NO: 2的氨基酸-I至-27是信号肽的SignalP程序(Nielsen等，1997，ProteinEngineering 10:1_6),成熟多肽是SEQ ID NO: 2的氨基酸I至194。在另一个方面,根据预测SEQ ID NO:4的氨基酸-I至-42是信号肽的SignalP程序(Nielsen等，1997，见上)，成熟多肽是SEQ ID NO:4的氨基酸I至296。成熟多肽编码序列术语“成熟多肽编码序列”意指编码具有木聚糖酶活性的成熟多肽的多核苷酸。在一个方面，根据预测SEQ ID NO: I的核苷酸I至81编码信号肽的SignalP程序(Nielsen等，1997，见上)，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO: I的核苷酸82至663。在另一个方面，根据预测SEQ ID NO: 3的核苷酸I至126编码信号肽的SignalP程序(Nielsen等，1997，见上)，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:3的核苷酸127至1014。 序列同一性参数“序列同一性”描述两个氨基酸序列之间或两个脱氧核糖核苷酸序列之间的相关性。就本专利技术而言，两个氨基酸序列之间的序列同一性程度使用如EMBOSS软件包(EMBOSS: The European Molecula本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：J林，J叶，A琼斯，S奥塔尼，T许，P卡斯兰德，E弗里斯，
申请(专利权)人：诺维信股份有限公司，诺维信公司，
类型：
国别省市：