一种基于抗体定向固定和纳米复合材料免疫传感器制备方法技术

本发明专利技术涉及一种基于抗体定向固定和纳米复合材料的免疫传感器制备方法，其特征在于：本发明专利技术采用谷胱甘肽作为空间手臂将抗克百威农药的单克隆抗体定向共价固定到纳米金胶表面，抗体的定向固定保持了抗体的生物活性以及自由的抗原结合位点来和农药有效的特异性结合，增强传感器的检测灵敏度。制备了一种新型纳米材料GS-PEI-Au纳米复合材料，用于改善石墨烯的水溶性、导电性以及稳定性。采用MWCNTs-CS和GS-PEI-Au两种复合纳米材料的协同作用共同修饰电极，显著的增强了电流响应，扩大了电极的有效固定面积，提高了电极表面抗体的有效固定量。将经过上述步骤修饰过的电极制成免疫传感器后，检测时间较短，灵敏度高，选择性稳定性好，再生能力好，回收率符合要求。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术提供一种基于抗体定向固定和纳米复合材料的免疫传感器制备方法，属于生物传感器

技术介绍
近年来，农药残留引起的中毒事件屡屡发生，果蔬中的有害、剧毒农药的残留问题一直是人们关注的焦点，也是现今中国加入WTO后，农产品出口遭遇“绿色壁垒”的主要影响因素之一。克百威是氨基甲酸酯类杀虫剂主要品种之一，它作为一种光谱杀虫剂被广泛应用于当今农业中。该药剂具有内吸性，能通过根、茎、叶或种子吸收传导，并输送到植物体的各器官，也能通过径流渗透污染地下水。研究发现克百威的代谢物可引起细胞强烈的DNA单链断裂，具有明显的细胞毒性。虽然近年来国际上在蔬菜上已禁用该农药，但由于其对某些作物具有生长刺激作用，所以仍有不少违章使用现象。具有这样高毒性的农药残留超标·的果蔬流入市场，必将会对人们健康造成严重危害，因此建立一种快速、灵敏、安全可靠的农药残留检测分析方法迫在眉睫。传统的用于检测农药残留的分析方法有气相色谱(GC)、高效液相色谱法(HPLC)、色谱/质谱联用技术(GC/LC-MS)、毛细管电泳法(CE)、荧光分析、酶联免疫(ELISA)等，这些传统的方法虽然具有高选择性和灵敏度，但其受到样品前处理耗时、仪器设备昂贵、操作人员技术要求高、检测时间长等诸多因素的限制，只能局限于实验室操作，不能满足果蔬现场速测的要求。免疫传感器是根据抗原和抗体特异性结合所引发的免疫反应的原理研制成的传感器，与传统的分析方法相比，它具有特异性强、分析速度快、结构简单、成本低廉等优点。在电流型免疫传感器的制备过程中，抗体(Ab)或半抗原(hapten)的固定化并保持其良好的生物活性、空间排布以及信号的放大是制约传感器灵敏度、稳定性、选择性以及再生性能等的关键因素。专利技术的目的在于提供一种能克服上述缺陷、操作简单、灵敏度高，选择性好的检测农药残留的电流型免疫传感器的制备方法。其技术方案为一种基于抗体定向固定和纳米复合材料的免疫传感器制备方法，其特征在于实现抗体定向固定，抗克百威的单克隆抗体(Ab)以谷胱甘肽(glutathione,G-SH)作为空间手臂被定向共价固定到纳米金胶表面。所述的一种基于抗体定向固定和纳米复合材料的免疫传感器制备方法，其特征在于分别制备多壁碳-壳聚糖(MWCNTs-CS)、石墨烯-聚乙烯亚胺-纳米金(GS-PEI-Au)两种纳米复合材料，并利用这两种纳米材料的协同作用共同修饰电极，以放大响应电流。所述的一种基于抗体定向固定和纳米复合材料的免疫传感器制备方法，其特征在于实验条件的优化，主要包括测试底液的pH、孵育温度以及孵育时间；所制备的免疫传感器的工作曲线为％Λ I = 14.275 + 11.087 IgC (ng/mL)，(R2=O. 9889.)，其检测限为O.03ng/mL ;免疫传感器性能检测包括特异性、稳定性、重现性、再生性以及免疫传感器对多种果蔬样品回收率的测定。其制备原理为本专利技术采用谷胱甘肽(glutathione，G_SH)作为空间手臂将抗克百威的单克隆抗体(Ab)定向共价固定到纳米金胶表面,其中G-SH通过金硫键牢固的固定到纳米金胶表面，G-SH末端羧基(-C00H)经I-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)-碳二亚胺(EDC)和1，6-己二胺(DAH)活化后，共价结合抗体C末端的-C00H，从而实现了 Ab定向连接在纳米金胶表面。抗体的定向固定保持了抗体的生物活性以及自由的抗原结合位点来和农药有效的特异性结合。采用多壁碳-壳聚糖(MWCNTs-CS)、石墨烯-聚乙烯亚胺-纳米金(GS-PEI-Au)两种纳米复合材料共同修饰电极，显著的增强了电流响应，扩大了电极的有效固定面积，提高了电极表面抗体的有效固定量。将经过上述步骤修饰过的电极制成免疫传感器后，检测农药的精度更高、实现小型、便捷、适用于现场检测的目的。采用本专利技术制成的免疫传感器可以在蔬果采收、上市前，进行农药克百威残留的快速测定，直接对农药残留是否超标量进行检测，避免因食含有残留农药的蔬果而引起中毒，为农产品安全生产与消费提供残留检测的技术支撑。为达到以上目的，采取以下技术方案实现一种基于抗体定向固定和纳米复合材 料的免疫传感器制备方法，其特征在于⑴通过共价方法将抗体定向的固定在纳米金胶表面，抗体的定向固定保持了抗体的生物活性以及自由的抗原结合位点来和农药有效的特异性结合；⑵基于MWCNTs-CS和GS-PEI-Au两种纳米复合材料的协同作用，将其共同修饰电极。本专利技术制备了一种新型纳米材料GS-PEI-Au纳米复合材料,用于改善GS的水溶性、导电性以及稳定性。采用MWCNTs-CS和GS-PEI-Au两种复合纳米材料的协同作用共同修饰电极，放大响应信号，增大电极的有效面积用于固定更多的抗体。另外，通过抗体的定向固定保持了抗体的生物活性以及自由的抗原结合位点，增强传感器的检测灵敏度。所述电流型免疫传感器的制备工艺如下⑴制备MWCNTs-CS纳米复合材料、GS-PEI-Au纳米复合材料以及AuNPs-Ab共轭物；[2)将MWCNTs-CS纳米复合材料修饰到清洗好的裸玻碳电极修饰上,烘干I I修饰GS-PEI-Au纳米复合材料，烘干；(5)修饰AuNPs-Ab共轭物，4°C孵育12h ;(6)将上述制备好的电极最后浸入1%的BSA溶液中室温下静置30min，以封闭电极上非特异性结合位点，室温下晾干，免疫传感器制作完成，保存在4°C条件下备用。具体实施例方式实施例(1) MWCNTs-CS纳米复合材料的制备将壳聚糖(CS)溶于I. 0%的醋酸溶液中，配成O. 25% CS溶液，室温下磁力搅拌lh，使壳聚糖完全溶解，然后用NaOH将混合液的pH调到5. O。称取Img MWNTs，加入ImL O. 25%壳聚糖溶液，再超声分散2h，最后得到稳定的黑色分散液(MWCNTs-CS纳米复合材料)。121 GS-PEI-Au纳米复合材料的制备称取3mg GS，加AlOmL去离子水，超声分散lOmin，得到GS分散液。在GS分散液中加入O. 2 mL I. O M PEI水溶液，超声分散lOmin，然后加入1.6 mL 21mM HAuCl4，将此混合液70°C水浴2h，取出，冷却至室温。15,000 rpm离心10 min,去除上清液,反复离心,将离心所得沉淀物溶解在I. 5mL去离子水中，超声分散5min，得到稳定的黑色分散液(GS-PEI-Au纳米复合材料)。该分散液在室温下可保持一个月的稳定性。HIAuNPs-Ab共轭物的制备取5 mL制备好的AuNPs溶液，加入4 mL 65 μ M的G-SH,搅拌10_15min,混合液于4500 rpm离心30min,离心产物悬浮在I mL PBS中，获得G-SH修饰的AuNPs。向此产物中加入300 μ L 58 mM EDC和3mL f MES缓冲溶液(pH 5. O)，在一个悬臂装置中4°C下放置I. 5 h，然后于15，000 rpm下离心I h分离出EDC活化了的AuNPs (EDC/AuNPs)，此反应物悬浮在I mL PBS中。向此反应物中加入50 μ L 500 μ M DAH，室温下混合30min，所得的反应混合物再次离心，获得DAH活化了的 AuNPs (DAH/EDC/本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于抗体定向固定和纳米复合材料的免疫传感器制备方法，其特征在于：制备了一种新型的GS？PEI？Au纳米复合材料，用于改善石墨烯的水溶性、导电性以及稳定性；采用MWCNTs？CS和GS？PEI？Au两种复合纳米材料的协同作用共同修饰电极，显著的增强了电流响应，扩大了电极的有效固定面积，提高了电极表面抗体的有效固定量。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：孙霞，朱盈，王相友，刘君峰，翟晨，
申请(专利权)人：山东理工大学，
类型：发明
国别省市：