本发明专利技术是申请号为201110192093.9的分案申请。属于分子生物学DNA标记技术与应用领域，具体涉及鮸鱼EST微卫星标记的特异引物及筛选方法。所述微卫星标记的特异引物的核苷酸序列分别为SEQIDNO.1至SEQIDNO.20所示。本发明专利技术建立了一种筛选方式，可方便快捷的用于做鮸鱼种质资源和遗传多样性的分析，分子种群遗传学、种质资源鉴定、遗传图谱构建和功能基因的研究，进一步用于鮸鱼的分子设计育种和资源调查。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于分子生物学DNA标记技术与应用领域，具体涉及海洋经济鱼类鯢鱼(.Miichthys miiuy) EST (Express Sequence Tag,表达序列标签)微卫星标记的特异引物及鯢鱼EST微卫星标记的筛选方法。
技术介绍
鯢鱼(Miichthysmiiuy),属脊索动物门(Phylum Chordata)、硬骨鱼纲(Osteichyes)、S卢形目(Perciformes)、石首鱼科(Sciaenidae )、鏡鱼属(Miichthys) 称米鱼、黑鯢，主要分布于西太平洋西部，包括中国的黄海及东海，朝鲜和日本南部，为近海暖温水性中下层鱼类。鯢鱼肉鲜嫩似黄鱼，无腥味，肉质可和野生大黄鱼相媲美，是海产经济鱼类之一，也是经济价值较高的鱼类，又具有个体大、生长快、食性广等诸多优点，是近海网箱养鱼优良品种。遗传改良或品种培育是鯢鱼养殖发展的动力，研究表明，遗传变异水平与生物的生长速度、抗病能力与生产性状密切相关，因此，开发鯢鱼的分子遗传标记，检测鯢鱼遗传多样性、研究其遗传结构，进而实施分子辅助育种，对于鯢鱼的育种和养殖都具有十分重要的意义。EST是通过对cDNA文库的克隆子随机测序得到的DNA序列，能反映mRNA的信息，是功能基因的一部分。与gSSR标记相比，从EST序列中筛选微卫星序列(EST-SSR)更经济、更有特点一方面具有了基因组微卫星标记的优点，同时又因EST是功能基因的表达片段，在其中发现的微卫星标记具备直接标记功能基因的优势，并可能同一些生产性状相关联，这些特点对遗传图谱构建以及标记辅助育种都有很高的应用价值。利用EST-SSR，可能把鯢鱼重要经济性状与之关联，达到分子辅助育种的目的，并可进一步进行鯢鱼功能基因的研究。目前还未见鯢鱼EST微卫星标记的研究报道。
技术实现思路
本专利技术旨在提供鯢鱼EST微卫星标记的特异引物，以及利用该特异引物进行鯢鱼EST微卫星标记筛选的方法。为实现本专利技术的专利技术目的，专利技术人提供如下技术方案 专利技术人首先提供了鯢鱼EST微卫星标记的特异引物，分别为Mimi-5-B04 F:CTACCGCTGCTCTTCG (SEQ ID NO. I), R:GATGGCTGGTCTACTTCG (SEQ ID NO. 2)；Mimi-13-G10 F:GCGACAACGCAGACAGGA (SEQ ID NO. 3), R:CTTGGGCGGATGGTAGGA (SEQ ID NO. 4)；Mimi-16-E10 F:GTTCTTTCACTGGCATCT (SEQ ID NO. 5), R:GCTGTTTCCACCTGTTTT (SEQ ID NO. 6)；Mimi-33-G06 F:GGTAGGAGACTGGGTGGT (SEQ ID NO. 7), R:CAATGTTTCAGGCAAATGTA (SEQ ID NO. 8)；Mimi-43-H04:F:GCTTCCTGTCCCGTTTAT (SEQ ID NO. 9), R:TTTGCTCCCGTGGGTTAT (SEQ ID NO. 10)；Mimi-40-H12 F:TCATCAGCACCAGCCTCTCSEQ ID NO. 11),R:CACATCCTCTTACCTCCTATCTCSEQ ID NO. 12)；Mimi-41-Ell:F:CCTCCTTCACCTCACCTT (SEQ ID NO. 13), R:ACATCTGTCCAGCCTCT (SEQ ID NO. 14)； Mimi-42-G06:F:TTGTTGTCTCGGTGATGG (SEQ ID NO. 15)，R:GACTCCTGCTGTTGCTCC (SEQ ID NO. 16)；Mimi-54-All F:AACCAAAGGGACCAAACG (SEQ ID NO. 17)，R:GGAGCAGGCAGGTAAACG (SEQ ID NO. 18)；Mimi-56-G05 F:AGACACCCGACCAGAACC (SEQ ID NO. 19), R:ACAGCCTCCATCCACAAA (SEQ ID NO. 20)。从鯢鱼ESTs序列进行微卫星分析的步骤是从专利技术人实验室测序获得的EST序列中，利用Tandem Repeat Finder (TRF)软件,参数设计如下按A、T、G、C排列组合的重复单元为2-6个核苷酸，且其最低重复次数分别为7、5、4、3、3，微卫星核心序列的最小长度为14bp，以此标准查找分析所得的序列，获得含有微卫星重复的EST序列；利用引物设计软件Primer Premier5. O在微卫星两端的侧翼序列设计特异引物。对于鯢鱼的ESTs设计引物，其引物设计参数为⑴引物长度为18_25bp;⑵GC含量大于40%;⑶退火温度大于40° C，且正反引物退火温度相差不超过5° C;⑷预期的PCR产物长度为100-300bp ;(5)尽量避免二级结构。本专利技术还提供了一种鯢鱼EST微卫星标记的筛选方法，首先利用从鯢鱼CDNA文库中测序获得的EST序列，利用微卫星检索软件Tandem Repeat Finder (TRF)进行微卫星位点的查找，对于2-6个碱基重复单元重复次数依次大于7，5，4，3，3次的微卫星片段进行筛选分离，从而得到含有微卫星重复的ESTs序列；然后在微卫星重复序列两端的侧翼序列设计特异引物，并进一步检测优化引物成为微卫星标记；最后对微卫星标记的重复性、稳定性和多态性进行综合评价，得到EST微卫星标记，其中，所述的筛选到的EST微卫星标记的特异引物分别为Mimi-5-B04 F:CTACCGCTGCTCTTCG (SEQ ID NO. I), R:GATGGCTGGTCTACTTCG (SEQ ID NO. 2)；Mimi-13-G10 F:GCGACAACGCAGACAGGA (SEQ ID NO. 3), R:CTTGGGCGGATGGTAGGA (SEQ ID NO. 4)；Mimi-16-E10 F:GTTCTTTCACTGGCATCT (SEQ ID NO. 5), R:GCTGTTTCCACCTGTTTT (SEQ ID NO. 6)；Mimi-33-G06 F:GGTAGGAGACTGGGTGGT (SEQ ID NO. 7), R:CAATGTTTCAGGCAAATGTA (SEQ ID NO. 8)；Mimi-43-H04:F:GCTTCCTGTCCCGTTTAT (SEQ ID NO. 9), R:TTTGCTCCCGTGGGTTAT (SEQ ID NO. 10)；Mimi-40-H12 F:TCATCAGCACCAGCCTCTCSEQ ID NO. 11),R:CACATCCTCTTACCTCCTATCTCSEQ ID NO. 12)；Mimi-41-Ell:F:CCTCCTTCACCTCACCTT (SEQ ID NO. 13), R:ACATCTGTCCAGCCTCT (SEQ ID NO. 14)；Mimi-42-G06:F:TTGTTGTCTCGGTGATGG (SEQ ID NO. 15)，R:GACTCCTGCTGTTGCTCC (SEQ ID NO. 16)；M本文档来自技高网...
【技术保护点】
鮸鱼EST微卫星标记的特异引物，其特征是所述的特异引物为：Mimi？13？G10：F:GCGACAACGCAGACAGGA，R:CTTGGGCGGATGGTAGGA。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：徐田军，王日昕，孙典巧，孙悦娜，
申请(专利权)人：浙江海洋学院，
类型：发明
国别省市：
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