本发明专利技术公开了重组脊髓灰质炎病毒Ⅰ型病毒样颗粒的制备方法。本发明专利技术所提供的方法包括如下步骤：1）将脊髓灰质炎病毒Ⅰ型的P1基因和3ABC基因克隆到目的质粒中，得到重组表达载体；2）用所述重组表达载体转化目的酵母细胞，得到表达所述P1基因和所述3ABC基因的重组酵母细胞；3）裂解所述重组酵母细胞，分离得到重组的脊髓灰质炎病毒Ⅰ型病毒样颗粒。实验证明，利用本发明专利技术所提供方法，在酵母表达系统中制备了脊髓灰质炎病毒Ⅰ型的病毒样颗粒，同时较野生型P1基因和3ABC基因相比，本发明专利技术对P1基因和3ABC基因的密码子优化大大提高了脊髓灰质炎病毒Ⅰ型的病毒样颗粒在酵母表达系统中的产量，可将其进一步用于生产婴幼儿手足口病候选预防性疫苗和药物组合物。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种重组脊髓灰质炎病毒I型病毒样颗粒的制备方法，特别涉及利用经过密码子优化的脊髓灰质炎病毒I型Pl基因和3ABC基因，通过酵母表达系统制备重组脊髓灰质炎病毒I型病毒样颗粒的方法。
技术介绍
脊髓灰质炎作为一种疾病，两百多年前已有文字记载，1789年Underwood首次对该病进行了描述。从 1948 年开始，人类开始不断确定不同脊髓灰质炎病毒株的数量，小儿麻痹症国家基金委员会1951年报道了只有3型脊灰病毒可以引起脊灰，根据血清型分别命名为I、II、III型。脊髓灰质炎病毒的三种抗原类型(血清I、IIJII型)除了免疫原型不同外，其他方面都非常类似。每型的基因组序列都已完全确定，包括3种Sabin 口服脊灰疫苗株。对于脊髓灰质炎病毒来说，只有蛋白质外壳的编码序列是独特的，因为在自然循环中，侧面的序列经常会通过与相近的肠道病毒(肠道病毒C种)重组而发生变化。脊髓灰质炎病毒普遍存在、传染性高并具有季节性(温带气候国家更明显)，未免疫人群中几乎所有人均可感染脊髓灰质炎病毒，脊髓灰质炎病毒感染者中少数人(小于1%)可出现麻痹症状，如顿挫型、非麻痹型和麻痹型脊髓灰质炎，也可引起无菌性脑膜炎。I型脊髓灰质炎病毒在3种型中最具神经侵袭性，多数脊灰流行及地方性流行病例都是由I型脊髓灰质炎病毒引起的，其次为III型和II型。传播高峰发生在婴儿和小年龄儿童(热带地区)及学龄儿童(温带地区)。脊髓灰质炎是人传人疾病，通过粪-口、口- 口途径传播，少数情况通过共同媒介(如水、牛奶)传播。其感染性主要在麻痹出现前及出现后f 2周，因此其传染期可能达41周，家庭易感者或其接触者的继发感染率很高(可能因为粪-口传播)，大于 90%。脊髓灰质炎病毒属于微小核糖核酸病毒科(Picornaviridae ),肠道病毒属(Enterovirus)。其毒粒为球形正二十面体立体对称,直径约为27_30nm,无包膜,其核衣壳包含单股正链RNA基因组，约由7500个核苷酸组成。其组成从5’端到3’端的方向依次为5’端非编码区，Pl区、P2区、P3区和一段3’端非编码区。Pl区编码病毒的主要结构蛋白，即衣壳蛋白，其转录及翻译产物经蛋白酶水解后，最终得到4个蛋白产物，分别为VP4(1A)，VP2(1B), VP3 (IC)及VP4 (ID)，其衣壳结构由60个亚单位片段组成，每个片段由4种衣壳蛋白(从VPl到VP4)组成。脊髓灰质炎病毒主要的中和抗原位点位于VP1，VP2和VP3上，通过中和单克隆抗体反应模式已经确定了 4个中和抗原的位点，这样的定位已经被高分辨率X涉嫌晶体学所证实。脊髓灰质炎可注射灭活疫苗(IPV)或口服减毒活疫苗(OPV)预防，尽管有两种非常有效的疫苗可以使用，脊髓灰质炎在世界范围内仍然是重要公共卫生问题。单价OPV可以克服一些三价OPV的局限性，包括3型Sabin株之间的相互干扰。因为三价OPV中II型组分比其他组分有明显较强的免疫原型，受种者通常II型血清首先发生阳转。相反，单价疫苗可以根据规划需求得到所要求的型特异性免疫应答。在发展中国家和发达国家单价OPV均表现出比三价OPV有较强的诱导型特异性免疫应答的免疫原型性。与OPV相关的主要不良反应是VAPP，其发生率是每100万OPV服疫苗中少于O. 3个病例，即< O. 3/100万剂；年平均VAPP的发病率为每100万人口发生O. 14例。免疫缺陷人群发生VAPP的风险性最高，几乎所有病例均发生在先天性或获得性免疫缺陷患者中。最近，一个带有历史因素的安全性问题被提出，与OPV—样，IPV中也含有猴病毒(SV40)，来自疫苗早期生产和使用过程中的原代恒河猴肾细胞。研究表明，SV40可以使培养的细胞发 生转化，并可导致动物产生肿瘤。根据报道，接受IPV免疫的全身性红斑狼疮病人中约有6%发病。病毒样颗粒在形态上和真实的病毒类似，并且不含有潜在的致病病毒基因组，所以病毒样颗粒为抗病毒预防性疫苗的开发提供了理想的备选方案。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供一种脊髓灰质炎病毒I型病毒样颗粒的制备方法。本专利技术所提供的脊髓灰质炎病毒I型病毒样颗粒的制备方法具体可包括如下步骤I)将脊髓灰质炎病毒I型的Pl基因和3ABC基因克隆到目的质粒中，得到重组表达载体；2)用步骤I)得到的重组表达载体转化目的酵母细胞，得到表达所述Pl基因和所述3ABC基因的重组酵母细胞；3)裂解步骤2)得到的重组酵母细胞，分离得到重组的脊髓灰质炎病毒I型病毒样颗粒。上述步骤I)中，所述Pl基因和所述3ABC基因均为经过密码子优化的基因；所述优化为在不改变野生型脊髓灰质炎病毒I型Pl蛋白和野生型脊髓灰质炎病毒I型3ABC蛋白氨基酸序列的前提下，将野生型脊髓灰质炎病毒I型Pl基因和脊髓灰质炎病毒I型3ABC基因的密码子替换为酵母细胞偏好(高频使用)的密码子。所述优化还包括对Pl基因序列和3ABC基因序列的其他改造，以适合在酵母细胞中表达。本专利技术中使用的术语“偏好的密码子”具有本领域公知的含义,也称为密码子的偏好性(CodonPreference)，是指某些生物体更偏爱使用某些同义三联密码子(即编码相同氨基酸的密码子)。在本专利技术的一个实施例中，上述步骤I)中所述Pl基因(经过密码子优化的基因，命名为Polio I PlY)的核苷酸序列为序列表中序列I所示；所述3ABC基因(经过密码子优化的基因，命名为Polio I 3ABCY)的核苷酸序列为序列表中序列2所示。为适合在酵母细胞中表达，根据本专利技术描述的方法对脊髓灰质炎病毒I型的Pl基因或3ABC基因进行改造获得的其他基因序列也属于本专利技术的保护范围。上述步骤2)中，所述目的酵母细胞可为酿酒酵母、多形汉逊酵母、巴斯德毕赤酵母、胞壁克鲁维氏酵母、乳克鲁维氏酵母或粟酒裂殖糖酵母。在本专利技术的一个实施例中，所述目的酵母细胞具体为酿酒酵母INVSCl。所述Pl基因和所述3ABC基因在所述重组表达载体中各由一个启动子驱动转录，驱动所述Pl基因的启动子方向和驱动所述3ABC基因的启动子方向相反。在本专利技术的一个实施例中，所述重组表达载体为将所述Pl基因和所述3ABC基因分别插入到pESC-URA的两个多克隆位点处得到的重组质粒，具体可将所述Pl基因插入到所述pESC-URA的多克隆位点I (MCS1/FLAG)的SpeI和Pac I之间，将所述3ABC基因插入到所述pESC-URA的多克隆 位点2 (MCS2/myc)的BamH I和Xho I之间，得到的重组质粒。利用本专利技术所提供的方法制备得到的脊髓灰质炎病毒I型病毒样颗粒也属于本专利技术的保护范围。本专利技术的另一个目的是提供密码子优化型的脊髓灰质炎病毒I型的Pl基因和3ABC基因。本专利技术所提供的密码子优化型的脊髓灰质炎病毒I型的Pl基因(Polio I PlY)的核苷酸序列为序列表中序列I所示；本专利技术所提供的密码子优化型的脊髓灰质炎病毒I型的3ABC基因(Polio I 3ABCY)的核苷酸序列为序列表中序列2所示。为适合在酵母细胞中表达，根据本专利技术描述的方法对脊髓灰质炎病毒I型的Pl基因或3ABC基因进行改造获得的其他基因序列也属于本专利技术的保护范围。其中，序列I由2646个核苷酸组成，为优化后脊髓灰质炎病毒I型Pl本文档来自技高网...
【技术保护点】
脊髓灰质炎病毒Ⅰ型病毒样颗粒的制备方法，包括如下步骤：1）将脊髓灰质炎病毒Ⅰ型的P1基因和3ABC基因克隆到目的质粒中，得到重组表达载体；2）用步骤1）得到的重组表达载体转化目的酵母细胞，得到表达所述P1基因和所述3ABC基因的重组酵母细胞；3）裂解步骤2）得到的重组酵母细胞，分离得到重组的脊髓灰质炎病毒Ⅰ型病毒样颗粒。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：盛望，王晓雯，陈立，赵淼，曾毅，李泽琳，刘伟，
申请(专利权)人：北京工业大学，
类型：发明
国别省市：
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