本发明专利技术公开了一种靶向基因shRNA干扰猪蓝耳病病毒增殖的转基因细胞系的构建方法，设计能有效阻止猪蓝耳病病毒增殖和复制的靶向基因shRNA，并通过转座子载体插入供体细胞的基因组，从而获得能有效阻止蓝耳病病毒感染的克隆细胞系。本发明专利技术还同时公开了重组载体PXL-BAC2-FRT-EGFP-NEO-shRNA的构建方法，包括设计靶向基因shRNA--ORF6-6e，通过PCR扩增zsGFP和NEO片段，将ORF6-6e的shRNA酶切连接到pMD18-T?Simple载体上，并通过酶切，回收、连接到PXL-BAC2载体上。本发明专利技术还同时公开了该转基因细胞系的用途：对PRRSV型病毒具有抑制作用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术设计一种抗猪蓝耳病病毒转基因细胞系的构建；具体地讲，本专利技术设计能有效阻止猪蓝耳病病毒增殖和复制的靶向基因ShRNA，并通过转座子载体插入供体细胞的基因组，获得能有效阻止蓝耳病病毒感染的Marc-145细胞克隆。
技术介绍
猪繁殖与呼吸综合症于上世纪80年代末首次在美国发现，其致病病原为猪繁殖与呼吸综合症病毒(PRRS virus, PRRSV)，主要造成母猪繁殖障碍和大量仔猪死亡，仔猪发病率100%，死亡率50%以上，母猪流产率达30%以上，是一种重要的动物疫病。近年猪蓝耳病在我国大面积暴发，防治高致病性蓝耳病的根本有效措施主要依靠 疫苗，但成本高、手续烦琐，而且价格非常昂贵，极大的增加了养殖成本，增加了猪农的负担，应用范围受到极大限制。猪蓝耳病(PRRS)是严重危害养猪业的病毒性传染病，死亡率极高，给我国养猪业造成了巨大的经济损失。虽然国内外对PRRS的疫苗研究非常活跃，但到目前为止，仍没有一种疫苗可对猪体产生完全安全的保护，普遍存在难以诱发较早和较高的抗体水平等问题。Marc-145细胞来源于猴肾细胞，从母细胞(MA 104细胞)克隆而得到，可连续传代培养。Marc-145细胞是目前对PRRSV最敏感的细胞系之一。
技术实现思路
本专利技术所要解决的问题是提供一种靶向基因shRNA干扰猪生殖与呼吸综合症病毒增殖和复制的转基因细胞系的构建方法及相应的重组载体PXL-BAC2-FRT-EGFP-NE0-shRNA的构建方法，为开辟控制猪PRRS感染和减少其危害提供技术支持。为了解决上述技术问题，本专利技术提供一种重组载体PXL-BAC2-FRT-EGFP-NE0-shRNA的构建方法，包括以下步骤I )、设计靶向基因shRNA 0RF6-6e 5’-gatccGCCATAGAAACCTGGAAGTTTCAAGAGAACTTCCAGGTTTCTATGGCTTTTTTg-----3’3’-----gCGGTATCTTTGGACCTTCAAAGTTCTCTTGAAGGTCCAAAGATACCGAAAAAActtaa-5，；2)、构建重组载体 PXL-BAC2-FRT-EGFP-NE0-shRNA 通过PCR 扩增 zsGFP 和 NEO 片段，将 0RF6_6e 所述的 shRNA 酶切(EcoRI-BamHI)连接到pMD18-TSimple载体上，并通过BglII-EcoRV酶切，回收、连接到PXL-BAC2 载体上，构建了重组载体 PXL-BAC2-FRT-EGFP-NE0-shRNA。本专利技术还同时提供了一种靶向基因shRNA干扰猪蓝耳病病毒增殖的转基因细胞系的构建方法设计能有效阻止猪蓝耳病病毒增殖和复制的靶向基因shRNA(即，0RF6-6e)，并通过转座子载体插入供体细胞的基因组，从而获得能有效阻止蓝耳病病毒感染的克隆细胞系。作为本专利技术的转基因细胞系的构建方法的改进，利用重组载体PXL-BAC2-FRT-EGFP-NE0-shRNA进行细胞转染，包括以下步骤将重组载体PXL-BAC2-FRT-EGFP-NE0-shRNA 用 lipofectin2000 (Invitrogen)转染试剂转染Marc-145细胞；到细胞增长接近汇合时按I :10密度(即细胞密度稀释10倍)传代，继续培养；培养基为含有10% (体积浓度)胎牛血清的DMEM (Gibco)基本培养基；S卩，该培养基的制备方法为在每升DMEM (Gibco)基本培养基中加入IOOml的胎牛血清；待细胞密度增至50% 70%汇合时，加入G418浓度为120(^g/ml的筛选培养基， 每3-5天更换一次G418浓度为120(^g/ml的筛选培养基；当有大量细胞死亡(即超过80%的细胞死亡)时，改用G418浓度为60(^g/ml的筛选培养基维持筛选(即，将G418浓度减半进行筛选);每3-5天更换一次G418浓度为600Pg/ml的筛选培养基；筛选10 14天后,有抗性的克隆细胞出现，改用含有10% (体积浓度)胎牛血清的DMEM (Gibco)基本培养基进行培养(即停药培养)，待克隆细胞逐渐增大后，将克隆细胞经胰酶消化后利用有限稀释法筛选阳性细胞单克隆；从而获得靶向基因shRNA干扰猪蓝耳病病毒增殖的转基因细胞系；上述培养和筛选的条件均为于37°C，5% CO2培养箱中培养。G418浓度为120(^g/ml的筛选培养基的制备方法为培养基中加入G418直至G418的浓度为120(^g/ml，该培养基为含有10% (体积浓度)胎牛血清的DMEM (Gibco)基本培养基。G418浓度为60(^g/ml的筛选培养基的制备方法为培养基中加入G418直至G418的浓度为60(^g/ml，该培养基为含有10% (体积浓度)胎牛血清的DMEM (Gibco)基本培养基。本专利技术还同时提供了利用上述方法构建而得的靶向基因shRNA干扰猪蓝耳病病毒增殖的转基因细胞系的用途对PRRSV型病毒具有抑制作用。本专利技术的具体技术方案如下步骤(I)、设计能有效阻止猪蓝耳病病毒的增殖和复制的靶向基因shRNA 1-1靶向基因shRNA设计根据PRRSV病毒的基因组序列，以0RF5和0RF6为目的基因，选取一段19bp长的核酸序列。该序列不要在5’和3’非翻译区，以及起始密码子后75bp ;将候选的19bp核酸序列，与相应的基因组进行比对，以确定该序列是特异性的只针对目的基因，与其他基因没有相似性。根据以上原则分别设计了 5对针对PRRSV-0RF5基因和5对针对PRRSV-0RF6基因的shRNA。1-2体外shRNA活性检测设计合成的shRNA序列经退火反应形成具有粘性末端的双链，直接连接到线性化的RNAi-Ready pSIREN-RetroQ-ZsGreen载体上，构建成RNA干扰载体；将上述质粒DNA,分别在转染试剂介导下导入Marc-145细胞，24小时后进行荧光观察，确定转染效率(图I)。转染24小时后对细胞接种PRRSV病毒，接毒72小时后将上清悬液和细胞分开收集，通过Real-Time PCR方法检测细胞中病毒相对表达量，分析所设计的shRNA对PRRSV型病毒的抑制作用(图2)。由图2可见，针对0RF5和0RF6设计的共10对shRNA均表现出抑制PRRSV病毒增殖复制的作用，但不同shRNA的抑制效果存在差异(O. 71%-67. 52%)。其中ORF6_6e的病毒相对表达量仅为O. 71%，表现出较显著的对PRRSV病毒复制与增殖的抑制作用，可作为转基因的候选shRNA序列。步骤(2)抗猪蓝耳病病毒增殖的转基因载体构建2-1抗猪蓝耳病病毒增殖的转基因载体构建。经体外shRNA活性检测，筛选出有效阻止PRRSV感染的shRNA，构建转基因重组载体PXL-BAC2-FRT-EGFP-NE0_shRNA (图3)。2-2抗猪蓝耳病病毒活性检测。将构建好的上述质粒DNA，在转染试剂介导下导入Marc-145细胞，24小时后进行荧光观察，确定转染效率。转染24小时后对细胞接种PRRSV病毒，接毒48-72小时后将上清悬液和细胞分开收集，通过Real-Time PCR方法检测病毒感染后，细胞中病毒相对表达量，分析转基因重组载体PXL-BAC2-FRT-E本文档来自技高网...
【技术保护点】
重组载体PXL？BAC2？FRT？EGFP？NEO？shRNA的构建方法，其特征在于包括以下步骤：1）、设计靶向基因shRNA：ORF6？6e：5“？gatccGCCATAGAAACCTGGAAGTTTCAAGAGAACTTCCAGGTTTCTATGGCTTTTTTg？？？？？3“3“？？？？？gCGGTATCTTTGGACCTTCAAAGTTCTCTTGAAGGTCCAAAGATACCGAAAAAActtaa？5“；2）、构建重组载体PXL？BAC2？FRT？EGFP？NEO？shRNA：通过PCR扩增zsGFP和NEO片段，将ORF6？6e？所述的shRNA酶切（EcoRI？BamHI）连接到pMD18？T？Simple载体上，并通过BglII？EcoRV酶切，回收、连接到PXL？BAC2载体上，？构建了重组载体PXL？BAC2？FRT？EGFP？NEO？shRNA。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：缪云根，周芳，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：
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