本发明专利技术公开了一种柑橘木虱特异性分子标记DNA序列及其鉴别引物和鉴别方法。该柑橘木虱特异性分子标记DNA序列如SEQ?ID?NO.1所示，其鉴别引物如SEQ?ID?NO.2和3所示。本发明专利技术克服了传统的研究捕食性天敌对害虫捕食效应的观察法和生化手段研究捕食者与猎物关系的程序的复杂性、费用高、缺乏对靶标的特异性等问题，提供了对柑橘木虱快速、准确、特异性鉴定的柑橘木虱特异性分子标记DNA序列及其鉴别引物和鉴别方法，为昆虫捕食行为研究提供有效的方法。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物化学与分子生物学领域，具体涉及柑橘木虱特异性分子标记DNA序列及其鉴别引物和鉴别方法。
技术介绍
柑橘木風(D iaphorina citri Kuwayama)属同翅目木風科,是柑橘黄龙病亚洲种和美洲种唯一的传播媒介。它取食黄龙病株后可终生带毒，且传毒率高。目前我国防治柑橘木虱主要采取砍树和化学防治两种措施。化学防治柑橘木虱虽然有一定的效果，但频繁的使用农药对生态环境破坏和产生严重的抗药性问题不容忽视。因此寻找新的防控方法与途径是一项迫切的任务。节肢动物捕食者被认为是控制害虫种群增长的重要因素之一。对可持续控制柑橘园害虫具有重要意义。然而，目前对捕食性天敌田间捕食柑橘木虱的定量评价还缺乏行之有效的方法，如何利用分子生物学技术定性与精确定量检测捕食性天敌对柑橘木虱捕食效能，准确分析柑橘木虱捕食性天敌谱将成为害虫防治技术突破的关键。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的是提供从柑橘木虱基因序列中克隆的，能用于柑橘木虱的物种鉴别和柑橘木虱捕食性天敌谱的检测的柑橘木虱特异性DNA分子标记。本专利技术通过设计特异性引物并进行PCR扩增，大量筛选柑橘木虱CO I分子标记， 获得420bp的DNA条带，经对其克隆、测序和同源比较，明确该条带可作为特异性分子标记，用于柑橘木虱的鉴别和捕食性天敌对柑橘木虱的捕食效能评价，从而实现了本专利技术的目的。本专利技术的柑橘木虱特异性DNA分子标记，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ IDNO. I所示。本专利技术的第二个目的是提供一对能特异性鉴别柑橘木虱的PCR引物，其特征在于，包括上游引物TGGAGCTCCCGATATAGCTTTC (SEQ ID NO. 2所示)和下游引物TCTCCACCTCCTGCTGGATCAA (SEQ ID NO. 3 所示)。本专利技术的第三个目的是提供一种能特异性鉴别柑橘木虱的试剂盒，包括PCR反应试剂和引物，其特征在于，所述的引物为上游引物TGGAGCTCCCGATATAGCTTTC和下游引物TCTCCACCTCCTGCTGGATCAA。用此引物扩增田间采集的害虫和天敌各物种基因组DNA样本，如有420bp扩增条带的为含有柑橘木虱物种的样本。因此本专利技术的第四个目的是提供一种鉴别柑橘木虱的方法，其特征在于，以上游引物TGGAGCTCCCGATATAGCTTTC 和下游引物TCTCCACCTCCTGCTGGATCAA 作为引物，通过 PCR的方法扩增DNA样本，如有420bp扩增条带的则为含有柑橘木虱物种的样本。本专利技术克服了传统的研究捕食性天敌对害虫捕食效应的观察法和生化手段研究捕食者与猎物关系的程序的复杂性、费用高、缺乏对靶标的特异性等问题，提供了对柑橘木虱快速、准确、特异性鉴定的柑橘木虱特异性分子标记DNA序列及其鉴别引物和鉴别方法，为昆虫捕食行为研究提供有效的方法。附图说明图I为用设计的鉴别引物对21个物种DNA样本进行PCR检测的琼脂糖凝胶电泳图。M DNAMarker ；1 :阴性对照水；2 :柑橘木風若虫nymph of Diaphorina citri ；3 阳性对照(喂食2头柑橘木風若虫的龟纹瓢虫)Positive control Propylea japonica ；4 龟纹瓢虫 Propylea japonica ；5 日本刀角瓢虫 Serangium japonicum ；6 :红肩瓢虫 Leisimidiate ；7 :小瓢虫亚属 Scymnus pullus(sp) ；8 :丽草蛉幼虫 Chrysopa sinica ；9 :八斑球腹蛛 Theridion octomaculatum ； 10 :大银腹蛛 Leucauge magnifica ；11 :草间小黑蛛 Erigonidium graminicolum ; 12 :斜紋猫蛛 Oxyopes sertatus ; 13 :微蟹蛛属 Lysiteles (sp)； 14 :黑细长蚁 Teraponera nigar ；15 :举腹蚁属 Crematogaster (sp) ； 16 牙虫 Aphidoideasp ；17 :柑橘黑刺粉風Aleurocanthus spiniferus ； 18 :红蜘蛛Tetranychus cinnbarinus ；19 :卷叶蛾 Homona magnanima ；20 :稻幢属 Oxya(sp) ；21 :红脊长畴 Tropidothoraxelegans ；22 :柑橘潜叶蛾 Phyllocnistis citrella ；23 :虫堂螂科 Mantidae (sp)。具体实施例方式以下实施例是对本专利技术的进一步说明，而不是对本专利技术的限制。实施例I :柑橘木虱特异性DNA分子标记序列的获得及应用采用单头匀浆法提取各物种基因组DNA参考安瑞生等(安瑞生，谭声江，陈晓峰.小型昆虫DNA提取时匀浆方法的改进.昆虫知识，2002，39 (4) :311-312)的方法，将单头虫用双蒸水清洗、吸干装入I. 5mL离心管，加入 50μ L 提取缓冲液 A ，-20°C放置5min后以研磨棒捣碎，然后用100 μ L提取缓冲液冲洗研磨棒；65°C水浴45min，中间取出混匀2次；加入等体积的提取液B ，冰上放置Ih以上；12000r/min离心IOmin,移上清液于另一离心管中12000r/min离心IOmin,加入2倍体积预冷的无水乙醇，混匀，放置_20°C Ih以上；12000r/min，离心lOmin，收集沉淀，用70%乙醇洗涤f 2次；晾干沉淀；每管加入50 μ LO. ΙχΤΕ，充分溶解后_20°C保存备用，即得到基因组DNA。采用PCR扩增技术，进行柑橘木虱特异性分子标记DNA序列的筛选针对柑橘木虱的COI基因设计特异性引物序列上游引物序列TGGAGCTCCCGATATAGCTTTC(如 SEQ ID NO. 2 所示)；下游引物序列TCTCCACCTCCTGCTGGATCAA(如 SEQ ID NO. 3 所示)。引物由英潍捷基(上海)贸易有限公司合成，并用于本实验所有供试物种DNA的扩士豳>曰οPCR 反应体系为 25 μ L Taq DNA 聚合酶 O. 5 μ L ； ΝΤΡ2μ L ；10Xbuffer2. 5 μ L ；上游引物IuL;下游引物luL;DNA模板luL;ddH2017uL。PCR扩增反应在EppendorfMastercyclerep基因扩增仪中进行,对照反应体系中的DNA模板以双蒸水代替。扩增程序为94°C预变性5min ;然后94°C变性30s，55°C退火30s，72°C延伸lmin，扩增35个循环；最后72°C延伸5min，得到PCR扩增产物。PCR扩增产物用1%的琼脂糖凝胶分离，电泳缓冲液为O. 5 X TBE,取PCR扩增产物IOyL与IyL上样缓冲液混合点 入胶孔。标准分子量为2000bp DNA Ladder (Takara提供)，100V恒压电流30min，凝胶成像系统观察拍照。样品I :将柑橘园采回来的，与柑橘木虱同域发生的节肢动物龟纹瓢虫Propylea japonica ;曰本刀角票瓜虫 Serangium japonicum ;红肩票瓜虫 Leis imidiate本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种柑橘木虱特异性DNA分子标记，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ？ID？NO.1所示。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：孟翔，欧阳革成，郭明昉，方小端，卢慧林，
申请(专利权)人：广东省昆虫研究所，
类型：发明
国别省市：
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