本发明专利技术公开了一种PCR扩增方法及其应用。本发明专利技术所提供的PCR扩增方法是将植物叶片直接作为模板，采用Phire热启动II?DNA聚合酶进行PCR扩增的方法；所述叶片为幼嫩叶片。本发明专利技术所提供的PCR扩增方法简单、快速、实用性强，获得的PCR检测结果准确、可靠，并且与传统的将种子发芽后取幼嫩叶片进行DNA的提取和PCR检测的方法相比，跳过了制备模板DNA的步骤，大大降低了检测时间和成本；本发明专利技术在转基因植物检测及新品种的培育中具有很大的应用前景和空间。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物
，涉及一种PCR扩增方法及其应用，特别涉及一种以叶片直接作为模板进行PCR扩增的方法，以及该方法在转基因植物检测中的应用。
技术介绍
目前，针对转基因植物检测的方法有很多种，主要基于不同检测目的，可分为以下几类首先，检测目的为鉴定外源基因整合与否及其整合拷贝数时可使用常规PCR检测法、多重 PCR法(Multiplex PCR,也称为 MPCR)、降落 PCR 法(Touchdown PCR, TD-PCR)、反向 PCR法(inverse PCR, IPCR)、以及Southern杂交检测法等等。其次,针对外源基因在转化植株中是否转录的检测与鉴定，可通过Northern杂交和实时定量PCR等方法进行检测。此外，检 测与鉴定转基因植株外源基因表达情况时可使用Elisa检测和Westhern杂交等方法。其中常规PCR法以其快速、准确、可重复性高等特点已成为转基因检测中应用最为普遍的方法。为了适应转基因技术的快速发展，提高检测检测效率，国内外都涌现出了大量基于PCR技术的检测方法，其中，武海斌(武海斌，路兴波，孙红炜等.转基因玉米转化体特异性PCR检测技术研究.玉米科学，2009，17⑴60-70.武海斌，孙红炜，李宝笃等.转基因玉米多重PCR-基因芯片联用的检测方法.农业生物技术学报，2009，17(6) :1075-1082.)等建立了一种将多重PCR与基因芯片结合的检测方法，其特点在于较高的准确性和灵敏度。而金芜军(金芜军，郝旸，程红梅等.用复合PCR方法检测6种转基因玉米中外源DNA的特异性.农业生物技术学报，2005，13(5) :562-567.)等则利用复合PCR的方法对不同转基因玉米中的外源DNA片段和玉米内参基因(zein)进行特异性检测。目前随着实验技术的发展，多种多样针对PCR实验革新使得PCR实验可实现简单快捷的规模化操作，大大节省了人力物力和时间成本。而在转基因植物检测过程中使用最为普遍的常规PCR法检测中制备DNA模板不仅是检测的第一步，也是保证检测结果准确与否的基础。目前主要使用CTAB法、SDS法等方法(Matsuoka T, KuribaraH,Akiyama H，et al.A multiplex PCR method of detecting recombinant DNAs fromfive lines of genetically modified maize. Journal of Food and Hygiene Society ofJapan, 2001, 42:24^32.)由待测样品中提取DNA作为PCR反应模板，这些方法操作复杂，提取时间较长，同时提取液中含有的苯酚，氯仿等试剂易对环境造成污染。在大规模检测中，DNA模板的提取已成为检测环节中耗时耗力最多的一个环节。特别是在转基因植物的回交转育过程中，需要进行大量的样本检测，而从田间取材获得的大量的叶片在长途的运输过程中要如何保证样品中的核酸不被降解，是一个相当棘手的问题，而往往消耗大量人力、物力和财力进行叶片的运输和保藏后进行检测的效果不尽理想。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种叶片直接PCR法及其在转基因植物检测中的应用。本专利技术所提供的叶片直接PCR法是将植物叶片直接作为模板，采用Phire热启动11 DNA聚合酶进行PCR扩增的方法。在所述方法中，所述叶片可为幼嫩叶片。在本专利技术的一个实施例中，所述幼嫩叶片具体为暗室中发芽的玉米黄化苗(苗高5 8cm)，或大田中正常培育的玉米4-5叶期之前叶片，或番茄自种子萌发后第一片真叶出现至花蕾显现时的叶片。为了达到更加理想的PCR效果，所述叶片在PCR反应体系中可以叶片面积小于等于O. 2平方毫米的组织块的形式存在，足以保证有足够的叶片创面与PCR反应体系溶液充分接触。在本专利技术的一个实施例中，所述PCR反应体系中的所述叶片是用打孔器打出的直径为O. 5mm的叶片组织块。实际操作中，最好使所述叶片悬浮在所述PCR反应体系中，如果所述叶片贴壁则会影响PCR反应结果。 在实际应用中，所述叶片在PCR反应体系中的含量为每20-25 μ I所述PCR反应体系中悬浮有1-2片叶片面积大于O. 03平方毫米小于O. 2平方毫米(直径为O. 2-0. 5mm)的所述叶片。在本专利技术的一个实施例中，所述叶片在PCR反应体系中的含量具体为每20 μ I所述PCR反应体系中悬浮有1-2片直径为O. 5mm的所述叶片，或所述叶片在PCR反应体系中的含量具体为每25 μ I所述PCR反应体系中悬浮有I片直径为O. 5mm的所述叶片。在所述方法中，所述植物可为单子叶植物，也可为双子叶植物。在本专利技术中，所述单子叶植物具体为玉米；所述双子叶植物具体为番茄。根据实际需要，所述方法中的所述PCR扩增可为单重PCR扩增，也可为多重PCR扩+ >曰ο更加具体地，当所述PCR扩增为单重PCR扩增(扩增目的基因单一)时，所述PCR反应体系中各成分的含量具体可为10mM Tris-HCl, 50mM KCl, I. 5mM MgCl2, 200 μ M dNTPeach，正反向引物各O. 5 μ Μ，IU Phire热启动II DNA聚合酶O. 4 μ I (按20 μ I体系计算)，所述PCR反应体系中每种待测叶片均悬浮有1-2片，其直径为O. 2-0. 5mm，余量为ddH20。当所述PCR扩增为多重PCR扩增(扩增的目的基因有多个)时，为了提高产物的特异性，可采用降落式PCR的方法。所述PCR反应体系中各成分的含量具体可为10mMTris-HCl, 50mM KCl, I. 5mM MgCl2, 200 μ M dNTP each，每种正反向引物各O. 5 μ M，IU Phire热启动II DNA聚合酶0.6μ1 (按25μ I体系计算)，2% (v/v)DMS0，所述PCR反应体系中每种待测叶片均悬浮有I片，其直径为O. 2-0. 5mm，余量为ddH20。进一步，为了高产物特异性，所述多重PCR扩增可使用降落PCR方法。在本专利技术的一个实施例中，所述目的基因具体为叶绿体DNA中的高度保守基因IRB18基因、以及转基因玉米NK603的转化体特异性序列，转基因玉米TC1507的转化体特异性序列，转基因番茄5345转化体特异性序列中的至少一种。扩增所述IRB18基因的引物为序列表中序列I和序列2所示的两条单链DNA，扩增所述转基因玉米NK603的转化体特异性序列的引物为序列表中序列3和序列4所示的两条单链DNA，扩增所述转基因玉米TC1507的转化体特异性序列的引物为序列表中序列5和序列6所示的两条单链DNA，扩增所述转基因番茄5345的转化体特异性序列的引物为序列表中序列7和序列8所示的两条单链DNA。本专利技术所提供的叶片直接PCR法在转基因植物鉴定中的应用，或在转基因植物培育中的应用也属于本专利技术的保护范围。在所述应用中，所述植物可为单子叶植物，也可为双子叶植物；在本专利技术的一个实施例中，所述单子叶植物具体为玉米；所述双子叶植物具体为番茄。本专利技术建立了一套以叶片直接作为模板进行PCR扩增的反应体系和条件，并将其成功应用于转基因植物的PCR检测中，该方法简单、快速本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种PCR扩增方法，其特征在于：所述方法是将植物叶片直接作为模板，采用Phire热启动II？DNA聚合酶进行PCR扩增的方法。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：任雯，刘亚，赵久然，陈浩，周秒依，
申请(专利权)人：北京市农林科学院，
类型：发明
国别省市：
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