本发明专利技术公开了一种抗副猪嗜血杆菌外膜蛋白OMP5的单克隆抗体、杂交瘤细胞株及应用。所述杂交瘤细胞株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCC2012135。由其制备的单克隆抗体特异性好，与猪大肠杆菌、猪巴氏杆菌、猪胸膜肺炎放线杆菌、猪链球菌和猪波氏杆菌均无交叉反应；效价高，纯化后的ELISA抗体效价可达1：204800；通用性强，对不同血清型副猪嗜血杆菌都能检测；可广泛用于副猪嗜血杆菌病的病原学诊断、血清学检测、免疫学检测及防治等。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于免疫学领域，具体涉及一种抗副猪嗜血杆菌外膜蛋白0MP5的单克隆抗体、杂交瘤细胞株及其应用。
技术介绍
副猪嗜血杆菌Parasuis, HPS)属于巴斯德菌科,嗜血杆菌属，是一种没有运动性、小型、NAD依赖、多形态的革兰氏阴性杆菌。HPS是一种常在菌，通常定植在猪的上呼吸道，并常常可在鼻腔内、扁桃体内和气管前段分离到，而不见其引起任何临床症状。HPS也是猪格拉泽氏病(Glasser’ s diseas)的病原。在一定条件下，HPS可造成以纤维素性多发性浆膜炎、关节炎、脑膜炎为特征的全身感染。格拉泽氏病已在全球范围内成为影响猪业的主要细菌性疾病，给养猪业带来巨大损失。迄今已发现的HPS至少有15种不同 的血清型，不同血清型菌株之间缺乏有效的交叉免疫保护性，这增加了预防格拉泽氏病的难度。因此，及时、准确、快捷而方便的病原学诊断方法对于猪格拉泽氏病的防治具有重要意义。目前国内对副猪嗜血杆菌的诊断主要有传统的病原分离，生化鉴定和血清学等方法，以及基于PCR的检测方法等。免疫学方法如ELISA、胶体金试纸条等具有特异性强、灵敏度高、操作简单、快速、对仪器依赖性低等特点，因而常被用于疾病病原检测以及药物痕量分析等领域。目前国内尚未有基于抗体的HPS检测的可商品化诊断方法。HPS的外膜蛋白(Outer member protein,0MP)是其主要毒力因子之一，而且免疫原性强。0MP5是其中主要的一种，各血清型HPS菌株都有0MP5。因此0MP5可作为HPS的特异性诊断靶位。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种分泌抗副猪嗜血杆菌外膜蛋白0MP5单克隆抗体的杂交瘤细胞株HPS 8D9，已于2012年9月25日保藏于中国典型培养物保藏中心(CHINACENTER FOR TYPE CULTURE COLLECTION)，保藏编号为 CCTCC C2012135。本专利技术还提供了由上述保藏编号为CCTCC C2012135的杂交瘤细胞株制备的单克隆抗体。本专利技术还提供了上述单克隆抗体在检测副猪嗜血杆菌外膜蛋白0MP5上的应用。本专利技术所采用的技术方案是 一种分泌抗副猪嗜血杆菌外膜蛋白0MP5单克隆抗体的杂交瘤细胞株HPS 8D9，于2012年9月25日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC C2012135。一种抗副猪嗜血杆菌外膜蛋白0MP5的单克隆抗体，由保藏编号为CCTCCC2012135的杂交瘤细胞株产生。所述单克隆抗体为IgG2b亚类。一种检测副猪嗜血杆菌抗体的试剂盒，含有保藏编号为CCTCC C2012135的杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体。一种检测副猪嗜血杆菌的试剂盒，含有保藏编号为CCTCC C2012135的杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体。本专利技术的有益效果在于 本专利技术制备得到的单克隆抗体具有以下优点 (1)特异性好，与猪大肠杆菌、猪巴氏杆菌、猪胸膜肺炎放线杆菌、猪链球菌和猪波氏杆菌均无交叉反应； (2)效价高，纯化后的ELISA抗体效价可达I:204800 ； (3)通用性强，对不同血清型副猪嗜血杆菌都能检测； (4)可大量生产； (5)可广泛用于副猪嗜血杆菌病的病原学诊断、血清学检测、免疫学检测及防治等。附图说明图I为本专利技术的技术流程 图2为单克隆抗体的特异性检测结果(M :蛋白Marke ；P5 0MP5 ；1 :猪大肠杆菌；2 :猪链球菌2型菌株；3 :猪多杀性巴氏杆菌菌株A ；4 :猪多杀性巴氏杆菌菌株B ；5 :猪胸膜肺炎放线杆菌菌株；6 :猪波氏杆菌菌株)； 图3为单克隆抗体的通用性检测结果(M :蛋白Marker ；P5 =OMP5 ;I :I型HPS ;2 :3型HPS ；3 :4 型 HPS ；4 :5 型 HPS ；5 :10 型 HPS ；6 :11 型 HPS ；7 :12 型 HPS ；8 :14 型 HPS ；9 15 型HPS ；10 :未定血清型HPS)； 图4为单克隆抗体用于检测HPS在PK15细胞上的粘附(激光共聚焦显微镜观察)(A 单克隆抗体HPS8D9 ；B -M 0MP5阳性血清对照；C :抗5型HPS全菌阳性血清对照；D 阴性血清对照)。具体实施例方式以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。在不背离本专利技术精神和实质的情况下，对本专利技术方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本专利技术的范围。若未特别指明，实施例中所用的化学试剂均为常规市售试剂，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。主要实验材料和来源 猪胸膜肺炎放线杆菌I型(APP259，购自中国兽药监察所)；HPS 3型菌株(SW114，澳大利亚昆士兰州动物健康研究所Pat Blackall博士惠赠);HPS 11型(H456，澳大利亚昆士兰州动物健康研究所Pat Blackall博士惠赠)；猪大肠杆菌、猪多杀性巴氏杆菌2株菌株、猪链球菌2型菌株、猪波氏杆菌、HPS I型菌株、HPS 4型菌株、HPS 5型菌株、HPS 10型菌株、HPS 12型菌株、HPS 14型菌株、HPS 15型菌株及I株未定型HPS菌株均由本实验室从广东地区病猪中分离、鉴定并保藏。一、免疫原的制备 将HPS 5型菌株在TSA平板上培养18 24h后，挑取单菌落接种于5mL TSB培养基中150rpm振荡培养10 12h，然后按照1% 4% (v/v)的比例接种于IOOmL TSB培养基中培养10h，梯度稀释，细菌计数，同时进行污染检查。6000r/min,离心IOmin后，用pH7. 4的PBS洗涤并制成IO9 CFU/ml浓度的悬液，加入O. 1% O. 4%的甲醛，37°C灭活24h，备用。二、动物免疫 选取体重在20g左右的雌性Balab/c小鼠。首次免疫，将灭活的HPS菌液与弗氏完全佐剂按I: I的比例进行混合乳化，剂量为O. I O. 5mL/只，注射方法为背部皮内多点注射。首免后每隔2 3周加强免疫一次，佐剂改用弗氏不完全佐剂。三免后I周左右，剪尾采血，收集血清；用表达纯化的HPS 5型菌株外膜蛋白0MP5 (制备方法详见文献陈善真，李春玲等，副猪嗜血杆菌0MP5基因的克隆、表达及间接ELISA检测方法的建立，中国农业科学，2011,44(14) :3036-3044)对血清中的抗体进行ELISA检测。免疫进行至抗体效价不再升高。选择抗体效价高的小鼠，在细胞融合前进3天腹腔注射灭活菌液O. I O. 5mL/只行一次加强免疫。三、杂交瘤细胞的融合、筛选与扩大培养 取效价较高免疫小鼠的脾细胞与骨髓瘤SP2/0细胞，按常规PEG融合法制备杂交瘤细胞；抗体用重组表达的OMP5进行间接ELISA检测，筛选阳性克隆并扩大培养；同时采用有限稀释法对阳性克隆进行亚克隆，至少进行3次，以保证能得到稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。筛选出高分泌特异性的杂交瘤细胞株HPS 8D9保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2012年9月25日，保藏编号为CCTCC C2012135。将其分泌的单克隆抗体命名为 HPS 8D9。ELISA所用溶液的配制 包被缓冲液(O. 05mol/L 碳酸盐缓冲液 pH9. 6) :1. 59g Na2CO3, 2. 93g N本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种分泌抗副猪嗜血杆菌外膜蛋白OMP5单克隆抗体的杂交瘤细胞株HPS？8D9，于2012年9月25日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC？C2012135。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：李春玲，
申请(专利权)人：广东省农业科学院兽医研究所，
类型：发明
国别省市：
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