孕马血清促性腺激素双抗体夹心ELISA试剂盒制造技术

本发明专利技术提供了一种孕马血清促性腺激素（PMSG）单克隆抗体杂交瘤细胞株D-3和A-4，其保藏编号为CGMCC?No.6450和CGMCCNo.6449。本发明专利技术还提供PMSG双抗体夹心ELISA检测试剂盒，其包括：包被PMSG单克隆抗体的酶标板、酶标记的PMSG单克隆抗体，捕获抗体和检测抗体分别针对PMSG蛋白不同的抗原决定簇。本发明专利技术检测试剂盒具有灵敏度高、特异性强、操作简便、检测定性快、定量准、重现性好等特点，并能对成品制剂进行标准校对，与现有商品化PMSG检测试剂盒相比，费用低、检测灵敏度高，且检测PMSG最低检测限为30mIU/ml，检测范围在30~200mIU，适合推广应用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种ELISA检测试剂盒，具体地说是一种检测孕马血清促性腺激素的双抗体夹心ELISA试剂盒。
技术介绍
孕马血清促性腺激素(Pregnant Mare Serum Gonadotrophin PMSG)又称马绒毛膜促性腺激素(equine chorionic gonadotropin, eCG)。PMSG 是从怀孕 40-120 天母马血液中提纯的一种糖蛋白激素，是一种经济实用的促性腺激素，在生产上常用以代替较昂贵的促卵泡素(FSH)而广泛应用于动物的诱发发情、超数排卵或增加排卵率(如提高双羔率)；对卵巢发育不全或雄性生精能力衰退等也都可收到一定疗效。由于孕马血清中PMSG的含量受多种因素的影响，不同妊娠期、不同品种、同一品种不同年龄及胎次等都对其影响较大。因此在用血清提纯PMSG之前，能对血清中PMSG效价进行检测，对于生产提纯具有重 要的指导意义。综合生殖激素的检测方法有多种多样，主要有放射性免疫分析法、免疫胶体金检测法、酶联免疫分析法(ELISA)、反向间接血凝法、色谱技术、化学发光技术及生物传感器技术等。目前，我国关于PMSG的检测有3种方法。其一是大鼠卵巢增重法，该法是依据《中华人民共和国兽药规范》(1993)血促性素(孕马血清促性腺激素PMSG)生物检定法，采用PMSG能促进大鼠卵巢增长的原理，将不同浓度的标准品注入相同来源的大鼠体内，根据卵巢增重情况绘制标准曲线，再将同体积待检样品注入同系相同生理状况的大鼠体内，测定其卵巢增重从而确定激素含量。由于该法灵敏度低、实验周期长、饲养实验动物变数大、影响因素较多，不易于生产与科研中推广应用。其二是反向间接血凝法，该法的原理是将纯化的PMSG抗体吸附到双醛化得羊红血球表面，遇到相应抗原，血球即被动凝集，按完全凝集孔样本的稀释倍数即可得到抗原的血凝效价。此法虽达到快速检测目的，但不同批次醛化红血球差异大，且抗体纯度要求高，质量要求均一，导致测定结果的差异大，也不适于生产应用。其三是放射性免疫检测法，使放射性标记抗原和未标记抗原(待测物)与不足量的特异性抗体竞争性地结合，反应后分离并测量放射性而求得未标记抗原的量。此法快速准确，样品需要量少，但由于此种方法具有高度放射性，对操作人员健康有害，同时检测所需的仪器较昂贵，也不利于推广应用。另外免疫胶体金检测法只能实现定性和半定量检测，目前阶段不宜推广使用。色谱技术、化学发光技术及生物传感器技术同样也可以用于激素检测，但由于其检测条件的限制性，在试验室中作为科研检测方法可以应用，但不适合于野外检测，对实际生产的指导意义不大。ELISA凭借其高度的灵敏度、良好的特异性、检测速度及低检测成本等优势已被广泛应用于生物、化学、医学、环境科学等学科的分析检测中。近年来，随着生物医学的研究进展，免疫学以其独特的优势有力的推动了医学和生物学中各个领域的发展。目前美国DRG公司生产的孕马血清促性腺激素快速检测试剂盒，能够在短短几个小时内完成多个样品的检测，准确省时。但由于进口价格昂贵，一个96孔检测板需要花费180(Γ2000元，同时由于DRG公司生产的试剂盒检测范围为0-80IU，国内有些马种的最高含量达到140IU，超出了其检测范围，因此急需建立一种快速、准确、省时、简便易操作的检测PMSG含量的方法并研制试剂盒，解决进口昂贵、检测范围窄的问题。
技术实现思路
本专利技术的目的之一在于提供一种孕马血清促性腺激素单克隆抗体。本专利技术的目的之二在于提供一种用于检测孕马血清促性腺激素的双抗体夹心ELISA试剂盒，以克服上述不足。本专利技术提供一种孕马血清促性腺激素PMSG单克隆抗体杂交瘤细胞株D-3，其保藏编号为 CGMCC No. 6450。本专利技术提供一种孕马血清促性腺激素PMSG单克隆抗体杂交瘤细胞株A-4，其保藏 编号为 CGMCC No. 6449。杂交瘤细胞株D-3和A-4已于2012年9月5日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，简称CGMCC，邮编100101)保藏，分类命名为杂交瘤细胞，保藏号分别为CGMCC No. 6450和CGMCCNo. 6449。本专利技术提供的一种孕马血清促性腺激素PMSG单克隆抗体，是由杂交瘤细胞株D-3或A-4分泌获得，所述杂交瘤细胞株D-3的保藏编号为CGMCC No. 6450，所述杂交瘤细胞株A-4的保藏编号为CGMCCNo. 6449。本专利技术提供一种用于检测PMSG的试剂、药剂或试剂盒，其包括上述的PMSG单克隆抗体。本专利技术提供一种检测PMSG的方法，包括使用上述的PMSG单克隆抗体。本专利技术还提供了上述PMSG单克隆抗体在制备检测PMSG试剂盒中的应用。本专利技术提供了一种检测孕马血清促性腺激素PMSG的双抗体夹心ELISA试剂盒，其包括(I)包被PMSG单克隆抗体的酶标板；(2)酶标记的PMSG单克隆抗体；其中，包被在酶标板的PMSG单克隆抗体与酶标记PMSG单克隆抗体分别针对PMSG蛋白不同的抗原决定簇。进一步地，本专利技术试剂盒中包被在酶标板的PMSG单克隆抗体与酶标记PMSG单克隆抗体分别为杂交瘤细胞株D-3或A-4分泌获得。优选地，所述包被在酶标板的PMSG单克隆抗体为杂交瘤细胞株D-3分泌获得，酶标记PMSG单克隆抗体为杂交瘤细胞株A-4分泌获得。所述杂交瘤细胞株D-3的保藏编号为CGMCC No. 6450，所述杂交瘤细胞株A-4的保藏编号为CGMCC No. 6449。本专利技术提供的PMSG试剂盒，还包括以下试剂中的一种或多种洗涤液、酶标抗体稀释液、底物显色液、终止液、PMSG标准品。本专利技术的试剂盒中，酶标记PMSG单克隆抗体的标记酶为辣根过氧化物酶，具体标记方法包括如下步骤取5mg的HRP溶于ImL三蒸水,加入新鲜配制的O. lmol/L NaIO4O. 2mL，室温下避光搅拌20min，混匀后装入透析袋中，以O. 001mol/L pH 4. 4醋酸钠缓冲液4°C透析过夜，加20 μ L0. 2mol/L ρΗ9· 5碳酸盐缓冲溶液，使pH升高到9. 0-9. 5，加入含有IOmg纯化PMSG单克隆抗体IgG lmL，混匀后装入预先活化的透析袋中，以O. 05mol/L pH9. 6碳酸盐缓冲液4°C透析过夜，使辣根过氧化物酶与抗体充分结合，取出透析袋中的液体，加入4mg/mL的硼氢化钠100 μ L，置4°C还原6_8小时，加入等体积的饱和硫酸铵，4°C放置过夜，3000rpm,离心IOmin,将所得的沉淀溶于Iml O. 01mol/L的PBS中，装入透析袋中以O.01mol/L的PBS透析过夜充分除去硫酸铵，透析24_36h，离心除去沉淀，即得纯化酶标记抗体。本专利技术试剂盒中，PMSG单克隆抗体的包被方法是将12. 44 μ g/mL的单克隆抗体按ΙΟΟμ L/孔加入到酶标板中，37°C孵育2h，用含0. 05%吐温-20和0. 05%叠氮化钠，ph7. 4的0. 02M磷酸盐缓冲液PBST溶液洗涤。本专利技术检测孕马血清促性腺激素试剂盒可以弥补国内生物检定方法的不足。仅需要几个小时就能测得结果，相对于生物检定法需要5天左右时间具有明显时间优势；相对于操作过程来说，本试验仅需要简单加样本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种孕马血清促性腺激素PMSG单克隆抗体杂交瘤细胞株D？3，其保藏编号为CGMCC？No.6450。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：韩国才，苏晓倩，邓亮，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：