本发明专利技术属于生物农药技术领域，具体涉及利用含利福平(50μg/ml)的LB平板筛选高产Iturin?A的鲍曼氏不动杆菌LCH0606菌株的RNA聚合酶突变体，该突变体的突变位点发生在编码RNA聚合酶β亚基rpoB基因的第1619个碱基、第1603个碱基和第1604个碱基，突变体生产抗真菌物质Iturin?A的能力较野生型LCH0606菌株提高95％～300％，抗真菌活性较野生型LCH0606菌株提高20％～70％，可用于多种作物病害以及药用植物连作障碍的防治。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物农药
,具体涉及一种高产抗真菌物质Iturin A的鲍曼氏不动杆菌LCH0606菌株的RNA聚合酶突变体的筛选及其应用。
技术介绍
随着人们对生活质量要求的提高以及环境生态面临的种种危机，农业生产面临的最大挑战就是如何在未来能够找到环境友好型的化学农药的替代品来抵抗农业病害，随着各国科学家的研究发现，源于有益微生物的生物农药是最有希望成为这类产品的替代品(Marc Ongena等，Cell，2007，16 (3) :115-125)。一方面微生物是地球上最庞大的生物类群，它不仅具有广泛的生物多样性，而且还可通过菌种选育、代谢调控、规模发酵以及其它现代生物工程技术大幅度提高目标物质的产量，易于实现工业化生产；另一方面，微生物杀 菌剂(活的微生物及其代谢产物)较化学农药更加安全，易降解，合成成本较低。其中基于Bacillus subtilis QST713和QST2808菌株的生物农药已由美国Agraquest公司生产，商品名为 SerenadeTM 和 Sonata AS (Cao CX 等，Agric. Nat. Resour, 2010, SAG-18-10)。然而，由于微生物农药中活性成分含量较低，严重制约了微生物农药的生产和推广。目前用于提高微生物农药中活性物质的方法主要有O优化培养基组成及发酵条件(Zmijewski M J等，J Antibiot，1986，39 (10) :1483) ； β前体控制及产物的衍生化处理(Boeck L D等，J Antibiot, 1990,43 (6) :607) ； 优良菌种的筛选及诱变育种(李晶等，安徽农业科学，2008，36(1) 106-111，132)。本专利技术核心突变体来源于鲍曼氏不动杆菌LCH0606 (Acinetobacterbaumannii LCH0606 ;菌种保藏号CGMCC No. 1752)及其生防菌专利产品(专利授权号ZL200610088339. 7)，该生防菌剂的抗真菌机理是能够合成广谱抗真菌物质Iturin A，其对大豆炭疽病、辣椒疫霉病、番茄灰霉病、小麦赤霉病及水稻纹枯病等病害有显著的防治效果，特别对药用植物地黄连作障碍有很好的控制作用。为此，本专利技术以此生防菌为基础，通过RNA聚合酶自然突变技术，获得了高产Iturin A的RNA聚合酶突变体，为Iturin A的产业化生产提供了一条新的途径和生产菌株。
技术实现思路
本专利技术主要目的是提供一种利用RNA聚合酶突变技术提高Iturin A的技术，获得的Iturin A产量提高的鲍曼氏不动杆菌LCH0606的RNA聚合酶突变体，并应用于植物病害和药用植物连作障碍的防治。本专利技术的技术方案I. LCH0606菌株RNA聚合酶突变体的获得O菌种的活化将菌株LCH0606于LB液体培养基中活化，然后接种于8支含LB液体培养基的试管中进一步培养。 突变菌筛选平板的制取将LB固体培养基加热融化后，加入一定浓度的利福平溶液于已融化的培养基中，摇匀后在无菌条件下以20-30ml的量倒于直径为90mm的平板中。将O中8支原始菌种种子液，分别以每平板200 μ L的接种量均匀涂布于8个 法制得的平板上。37°C暗处培养2天后取出，所见菌落即有可能为RNA聚合酶突变体，进而通过对该突变体中rpoB基因的PCR和PCR产物的序列分析，进一步确定突变体的突变基因是否发生在编码RNA聚合酶β亚基的rpoB基因上。2.突变体及其生产Iturin A的含量测定 通过抑制植物病原真菌活性实验和HPLC检验，确定高产突变体的抗真菌活性及所产生的Iturin A的含量。3.高产突变体突变基因位点的确定利用细菌DNA提取试剂盒，提取个突变体的DNA，并用一系列弓I物进行PCR扩增，获得完整的rpoB基因序列，经序列分析以及与野生型菌株rpoB序列的同源性比对，找出突变碱基及相应的氨基酸。4.突变体及其产生的Iturin A对植物病原真菌的防治实验采用皿内实验，测定各突变体发酵液及其无菌滤液抗植物病原真菌生长活性。5.突变体在防治地黄连作障碍中的作用采用浸种处理方式，研究LCH0606菌株突变体在防治地黄连作障碍中的作用。浸种时间为30分钟。 本专利技术与现有技术相比的有益效果所获得的突变体产生的Iturin A较野生菌株显著提高(95% 300% )，而且抗生素的产生时间提前，抗真菌活性较野生型LCH0606菌株提高20% 70%。未经过人为诱导，所得突变体来自于野生型菌株的自然突变，突变体的生理生化特性以及遗传性状相对稳定。所获得的突变体及其所产生的Iturin A可应用于防治大豆炭疽病(Glomerella glycines)、小麦赤霉病(Fusarium graminearum)、7jC稻纹枯病(Rizoctoniasolani)、交链抱叶斑病(Alternaria alternata)、辣椒疫霉病(Phytophthora capsici)以及药用植物地黄连作障碍。附图说明图I.野生型鲍曼氏不动杆菌LCH0606 (WT)与其RNA聚合酶突变体对植物病原真菌交链孢(Alternaria alternata)的抑制作用。图2.野生型鲍曼氏不动杆菌LCH0606 (WT)与其RNA聚合酶突变体生产IturinA的比较。图3.野生型鲍曼氏不动杆菌LCH0606 (WT)与其RNA聚合酶突变体(Abm03)防治药用植物地黄连作障碍后的病害严重度。图4.野生型鲍曼氏不动杆菌LCH0606 (WT)与其RNA聚合酶突变体(Abm03)防治药用植物地黄连作障碍后的增产效果。具体实施例方式I. RNA聚合酶突变体的筛选O菌种的活化 将野生型鲍曼氏不动杆菌LCH0606 (WT)与其RNA聚合酶突变体生产以I %的接种量接种于4mL/管的LB液体培养基，37°C，120rpm活化培养48h，然后以相同的接种量和培养条件进行二次活化于8支LB液体培养基中，培养24h。 含利福平平板的制备将利福平溶液添加到50 60°C的LB固体培养基中，终浓度为50 μ g/mL,即为含 利福平平板。将O中制备的二次活化种子液(8支试管)，按200 μ L/皿的量分别均匀涂布于含利福平平板上，37°C暗处培养2天后观察菌落，即为可能的RNA聚合酶突变体，共筛得78株突变体。2.高产突变体及其Iturin A含量的确定O抑制植物病原真菌活性实验以交链孢为测试植物病原真菌。发酵液在12000rpm、IOmin离心去除细胞后，所得无菌上清液Iml与IOmL PSA培养基混合倒入培养皿(直径9厘米)，冷却后接种新鲜的测试真菌菌饼(直径7mm)，菌饼倒扣于每个培养皿中，28 °C培养48小时后测量菌落直径，计算生长抑制率。生长抑制率(％)=X 100 %。结果(见图I)显示，突变体Abm03、Abm05和Abm28的抗真菌活性较野生型菌株提高 20% 70%。Θ Iturin A 产量的 HPLC 检测样品处理定量取Abm03、Abm05和Abm28发酵液，离心获得上清液后，对于IturinA的检测，检测条件为流动相A泵5mM醋酸铵(色谱纯)，B泵乙腈，A B为55 45 ;流速1毫升/分钟；检测器220nm。结本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种高产抗真菌物质Iturin？A的RNA聚合酶突变体，其特征是以产Iturin？A的植物内生菌——鲍曼氏不动杆菌LCH0606为基础，用浓度为50μg/ml的利福平LB平板筛选该菌的RNA聚合酶突变体。该突变体的抗真菌活性较野生型提高20％～70％，抗真菌活性物质Iturin？A产量较野生型菌株提高95％～300％。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：刘常宏，
申请(专利权)人：刘常宏，
类型：发明
国别省市：
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