一种高偶联率高活性重金属全抗原的制备方法，通过改良重金属全抗原的合成顺序，首先将过量的重金属离子与双功能螯合剂反应，反应完全后，用NaOH溶液调节pH，离心沉淀，去除过量的重金属离子，获得金属离子-螯合剂复合物，使之与生物大分子的反应能力减弱，然后将金属离子-螯合剂复合物与载体蛋白偶联，保证了所制备全抗原中蛋白的活性，制备了具有高偶联率、高活性的重金属全抗原。经小鼠免疫试验证明，所制备高偶联率、高活性的重金属抗原，其免疫原性好，方法重复性高，简单易行。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种高偶联率、高活性重金属全抗原的制备方法，属于免疫化学及残留分析生物
技术介绍
重金属是指比重大于5 g*cm_3的金属元素，在自然界中大约存在45种。但是，由于不同的重金属毒性差别很大，所以在环境科学中人们通常关注Hg、Cd、Pb、Cr、CU、Co、Ni等。在天然水体中只要有微量重金属即可产生毒性效应，重金属是一类具有积蓄性的对环境永久有害的物质，且不能通过化学或生物修复过程转变为无害物质。生物从环境中摄取重金属可以经过食物链的生物放大作用，在较高级生物体内成千万倍地富集起来，然后通过食物进入人体，在人体的某些器官中积蓄起来造成慢性中毒，危害人体健康。被重金属 污染的地区，必须进行定期检测。目前，国内重金属污染检测主要采用理化分析方法，包括紫外分光光度法UV、石墨炉原子吸收光谱法GFAA S、火焰原子吸收光谱法FAAS、电感耦合等离子体质谱法ICP-MS、电感耦合等离子体原子发射光谱法ICP-AES等，但这些方法均存在需要昂贵的仪器设备、熟练的专业人员、烦琐费时、周期长、费用高、不能现场操作、样品筛检量小等缺陷。重金属离子免疫学检测方法是一种新型的分析方法，具有省时省力、费用低廉、便于携带、操作简便、高灵敏度和特异性等优点。实现重金属免疫分析测定技术关键在于合成的重金属全抗原以获得相应抗体。重金属全抗原的制备，传统一步螯合法是采用双功能螯合剂先与载体蛋白结合得到载体蛋白-螯合剂复合物，再向其中加入重金属离子一步螯合制得全抗原。在传统一步螯合反应中，由于重金属离子会严重破坏载体蛋白的二级结构，使载体蛋白变性，载体蛋白的变性程度与重金属离子的浓度成正相关性；然而，为了得到较高的半抗原偶联比，必须提高重金属离子的起始反应浓度，因此，传统一步螯合法制备重金属全抗原在保存全抗原中载体蛋白的活性与提高半抗原偶联比之间存在矛盾，必然使所制备的重金属抗原偶联率低或活性低。
技术实现思路
针对重金属与蛋白快速大量结合后易导致蛋白变性这一特点，本专利技术旨在解决现有方法合成的全抗原偶联率低、活性低、免疫效果差的问题，改良传统一步螯合法，制备出高偶联率、高活性、免疫原性好的重金属全抗原。实现本专利技术的技术方案如下通过改良重金属全抗原的合成顺序，首先将过量的重金属离子与双功能螯合剂反应，反应完全后，用NaOH溶液调节pH，离心沉淀，去除过量的重金属离子，获得金属离子-螯合剂复合物，使之与生物大分子的反应能力减弱，然后将金属离子-螯合剂复合物与载体蛋白偶联，保证了所制备全抗原中蛋白的活性，制备了具有高偶联率、高活性的重金属全抗原。本专利技术的工艺步骤是 (1)配置浓度为O.I X 10 311101/1 10.0\10-311101/1的双功能螯合剂-(S-S)环己烧-I, 2 二乙基二胺五乙酸p-NH2-Bn-CHX-A”-DTPA溶液，向其中振荡滴加浓度为O. I mo I/L "I. O mol/L的重金属盐溶液，要求加入的重金属离子与双功能螯合剂的物质的量之比η重ηβ= I 10 :1,每2-10s滴加一滴,得溶液A ;重金属离子是Hg2+、Cd2+、Pb2+、Cr2+、Cu2+、Co2+、Ni2+中的一种，重金属盐溶液是硝酸盐或盐酸盐； (2)将溶液A在10-35°C避光恒温反应8h 30h，反应完全后，用O.I mol/L NaOH溶液调节pH为7. O 10. O, 3000r/min离心IOmin去沉淀,得溶液B ； (3)配置浓度为I.O X 10 4mol/L 5.0X10_4 mol/L的载体蛋白溶液，向其中振荡滴加上述溶液B，要求加入的螯合剂与载体蛋白的物质的量之比ηβ :η蛋白=40 70 :1，每 2^10s滴加一滴；20分钟后再向反应液中加入偶联剂戊二醛，要求加入的偶联剂与螯合剂的物质的量之比:ηβ= 1^5 :1,每2"10s滴加一滴；反应完全后,得溶液C ;载体蛋白是牛血清白蛋白BSA、人血清白蛋白HAS、钥孔血蓝蛋白KLH、卵清蛋白0VA、甲状腺球蛋白BTG中的一种； (4)用0.IM，pH7. 4的N-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙磺酸缓冲液HBS或者羟乙基哌嗪乙磺酸HEPPS缓冲液，透析溶液C，时间为I 3天，得溶液D，即高偶联率高活性重金属全抗原。本专利技术的有益效果是本专利技术改良一步螯合法，通过改变全抗原的合成顺序，所制备的全抗原，经原子吸收与紫外分光光度计检测，蛋白与重金属偶联率是传统一步螯合法的两倍以上；经园二色谱检测，载体蛋白构象破坏程度远远低于一步螯合法。经小鼠免疫试验证明，所制备高偶联率、高活性的重金属抗原，其免疫原性好，方法重复性高，简单易行。以重金属铅离子全抗原的免疫效果为例，酶联免疫吸附剂测定ELISA检测小鼠免疫血清效价与特异性差异。四免后小鼠效价与差异率Differenced)达到最高，小鼠血清稀释25600后，不同免疫方案免疫小鼠的血清效价检测结果及差异率计算结果如表I所示，Yc 号小鼠血清差异率比较大达到148. 74 %，且效价较高，推断其产生了特异性较强的铅抗体Ach1, Ych1号小鼠可能产生了部分特异性抗体，但其特异性不明显；其余小鼠由于其效价低或特异性差异不明显，证明其未产生针对铅的抗体，不具备进一步实验的价值。对于同种抗原免疫小鼠间的差异，可以推断与小鼠个体差异有关，而不同抗原间效价与特异性差异，可能与免疫抗原的偶联比及活性有关。表I ELISA检测小鼠免疫血清效价与特异性差异权利要求1.，其特征是 (1)配置浓度为O.I X 10 311101/1 10.0\10-311101/1的双功能螯合剂-(S-S)环己烧-I, 2 二乙基二胺五乙酸p-NH2-Bn-CHX-A”-DTPA溶液，向其中振荡滴加浓度为O. I mo I/L "I. O mol/L的重金属盐溶液，要求加入的重金属离子与双功能螯合剂的物质的量之比Iii ηβ= I 10 :1，每2-10s滴加一滴,得溶液A ； 重金属离子是Hg2+、Cd2+、Pb2+、Cr2+、Cu2+、Co2+、Ni2+中的一种，重金属盐溶液是硝酸盐或盐酸盐； (2)将溶液A在10-35°C避光恒温反应8h 30h，反应完全后，用O.I mol/L NaOH溶液调节pH为7. O 10. O, 3000r/min离心IOmin去沉淀,得溶液B ； (3)配置浓度为I.O X 10 4mol/L 5.0X10_4 mol/L的载体蛋白溶液，向其中振荡滴加上述溶液B，要求加入的螯合剂与载体蛋白的物质的量之比ηβ :η蛋白=40 70 :1，每2^10s滴加一滴；20分钟后再向反应液中加入偶联剂戊二醛，要求加入的偶联剂与螯合剂的物质的量之比η偶ηβ= 1^5 :1,每2 10s滴加一滴；反应完全后,得溶液C ； 载体蛋白是牛血清白蛋白BSA、人血清白蛋白HAS、钥孔血蓝蛋白KLH、卵清蛋白0VA、甲状腺球蛋白BTG中的一种； (4)用0.IM，pH7. 4的N-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙磺酸缓冲液HBS或者羟乙基哌嗪乙磺酸HEPPS缓冲液，透析溶液C，时间为I 3天，得溶液D，即高偶联率高活性重金属全抗原。全文摘要，通过改良重金属全抗原的合成顺序，首先将过量的重金属离子与双本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种高偶联率高活性重金属全抗原的制备方法，其特征是：（1）配置浓度为0.1？×？10？3mol/L？~10.0×10？3？mol/L的双功能螯合剂[(R)？2？氨基？3？(4？氨基苯基)丙基]？（S？S）环己烷？1,2二乙基三胺五乙酸p？NH2？Bn？CHX？A”？DTPA溶液，向其中振荡滴加浓度为0.1？mol/L？~1.0？mol/L的重金属盐溶液，要求加入的重金属离子与双功能螯合剂的物质的量之比n重：n螯＝1～10：1，每2？10s滴加一滴，得溶液A；重金属离子是Hg2+、Cd2+、Pb2+、Cr2+、Cu2+、Co2+、Ni2+中的一种，重金属盐溶液是硝酸盐或盐酸盐；（2）将溶液A在10？35℃避光恒温反应8h～30h，反应完全后，用0.1？mol/L？NaOH溶液调节pH为7.0~10.0，3000r/min离心10min去沉淀,得溶液B；？（3）配置浓度为1.0？×？10？4mol/L？~5.0×10？4？mol/L的载体蛋白溶液，向其中振荡滴加上述溶液B，要求加入的螯合剂与载体蛋白的物质的量之比n螯：n蛋白＝40～70：1，每2~10s滴加一滴；20分钟后再向反应液中加入偶联剂戊二醛，要求加入的偶联剂与螯合剂的物质的量之比n偶：n螯＝1~5：1，每2~10s滴加一滴；反应完全后，得溶液C；载体蛋白是牛血清白蛋白BSA、人血清白蛋白HAS、钥孔血蓝蛋白KLH、卵清蛋白OVA、甲状腺球蛋白BTG中的一种；（4）用0.1M？，pH7.4的N？2？羟乙基哌嗪？N？2？乙磺酸缓冲液HBS或者羟乙基哌嗪乙磺酸HEPPS缓冲液，透析溶液C，时间为1～3天，得溶液D，即高偶联率高活性重金属全抗原。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：罗舜菁，刘成梅，王文飞，邹常春，万婕，钟业俊，
申请(专利权)人：南昌大学，
类型：发明
国别省市：
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