本发明专利技术公开了一种HIV-1肽Env120-128特异性TCR、其重组逆转录病毒载体与应用。本发明专利技术成功筛选出HIV-1肽Env120-128(KLTPLCVTL)特异的TCR基因，利用逆转录病毒载体将其转染到CD8+T细胞中，获得表达HIV-1肽Env120-128特异TCR的CD8+T细胞。该经过TCR基因修饰的CD8+T细胞可成功表达外源性TCR基因，特异性识别HIV肽Env120-128并介导IFN-γ、TNF-α细胞因子分泌和细胞毒活性，具有艾滋病及艾滋/结核共感染疾病基因治疗的应用价值，可为艾滋病及艾滋/结核共感染疾病的过继细胞免疫治疗开辟新径。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物工程领域，具体涉及一种Hiv-I肽特异性T细胞受体(TCR)，以及利用该TCR制备得到的一种用于艾滋及艾滋/结核共感染疾病基因治疗的逆转录病毒载体，逆转录病毒载体转染得到的CD8+T细胞及其在制备抗艾滋及艾滋/结核共感染疾病药物中的应用。
技术介绍
人类免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus,HIV)即艾滋病病毒,入侵人 体后将严重破坏人体免疫力，使各种罕见感染及癌症得以在人体内发生，最终形成艾滋病(获得性免疫缺陷综合症)。HIV主要存在于HIV感染者或艾滋病患者体液中，任何能够引起体液交换的行为都有传播HIV的可能，包括性接触传播、血液传播及母婴传播。自上世纪80年代HIV开始在人类中传播以来，将近6000万人感染，其中2500万人死亡。目前尚无可根除HIV、根治艾滋病的药物，也没有证据表明人体会对HIV产生保护性免疫，因此大多数艾滋病病人死于反复继发感染及肿瘤。艾滋病的治疗一方面是抑制病毒在体内的繁殖，增强免疫功能；另一方面是防治机会性感染，缓解症状，延长生命。早期治疗和预防其它感染可延缓病程发展，提高生活质量。目前临床上常用的治疗方法有以下几个方面(1)联合使用几种抗逆转录毒药物的“鸡尾酒疗法”实施抗逆转录病毒治疗，其在降低发病率和病死率、提高生活质量方面有明显作用；(2)针对各种机会性感染的抗生素对症治疗与预防，包括肿瘤的化疗和对症治疗；(3)其他，包括免疫调节治疗、营养支持治疗和中医药治疗等。HIV-I肽Env12Q_128，即艾滋病病毒HIV-1包膜蛋白gpl60的第120-128位氨基酸构成的肽表位(KLTPLCVTL)，存在于80%的多变性HIV-I肽序列中，在HIV-I B亚型病毒株中具有最高度的保守性，可被表达HLA-A*0201的个体识别。T细胞抗原受体(T cell receptor, TCR)是所有T细胞表面的特征性标志，在T细胞抗原识别中起关键作用。TCR是由α、β两条肽链构成的异二聚体，每条肽链又可分为可变区(V区)，恒定区(C区)，跨膜区和胞质区等几部分；其胞质区很短，信号传递主要通过与其以非共价键结合的CD3分子进行。TCR分子属于免疫球蛋白超家族，其抗原特异性存在于V区；V区(Va、νβ)又各有三个高变区⑶R1、⑶R2、⑶R3，其中以⑶R3变异最大，直接决定了 TCR的抗原结合特异性。在TCR识别MHC-抗原肽复合体时，⑶R1XDR2识别和结合MHC分子抗原结合槽的侧壁，而CDR3直接与抗原肽相结合。根据TCR να、νβ基因的同源性，可将80多个TCR Va基因分为32个家族、60多个TCR νβ基因分为24个家族。利用每个T细胞克隆均有其独特CDR3序列的特点，采用CDR3谱型分析技术，可测定各TCR家族各CDR3出现的频率，由此反映T细胞的克隆性。未接受抗原刺激的T细胞中，针对各种抗原的T细胞克隆分布均匀，表现为多家族和多克隆性，具体地，表现为各家族均出现呈高斯分布的约8个CDR3峰；抗原刺激则引起识别该抗原的某一个或几个特异TCR家族T细胞反应性增生，表现为该家族CDR3成员出现少于4个峰的寡克隆或单克隆分布，其中具有单克隆CDR3分布(表现为单峰)的TCR家族即是抗原特异单克隆增生的TCR家族。对该家族PCR产物进行测序，可获得抗原特异TCR CDR3序列。
技术实现思路
本专利技术的目的在于筛选出HIV-I肽Env12Q_128 (KLTPLCVTL)特异的TCR基因，利用逆转录病毒载体将其转染到⑶8+ T细胞中，获得表达HIV-I肽Eiw12ch128特异TCR的⑶8+ T细胞，以及该经过TCR基因修饰的 ⑶8+ T细胞在制备抗HIV药物中的应用。本专利技术所采用的技术方案是 HIV-I肽Eiw12ch128特异性T细胞受体(TCR)，包括α链和β链，其中，α链的CDR3区含有SEQ ID NO: 3所述的序列；β链的⑶R3区含有SEQ ID NO: 4所示的序列。优选的，所述HIV-I肽Eiw12ch128特异性TCR的α链是由SEQ ID NO: 10所示的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸和/或末端修饰后所得到的能特异与外源性β链装配成TCR蛋白分子的氨基酸序列；β链是由SEQ ID NO: 6所示的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸和/或末端修饰后所得到的能特异与外源性α链装配成TCR蛋白分子的氨基酸序列。优选的，所述Hiv-I肽Env120^128特异性TCR的α链氨基酸序列如SEQ ID NO: 12所示，β链的氨基酸序列如SEQ ID NO: 8所示。编码Hiv-I肽Eiw12ch128特异性TCR的基因。一种HIV-I肽Eiw12ch128特异性TCR的融合基因，其序列如SEQ ID NO: 13所示。一种重组逆转录病毒载体，含有编码HIV-I肽Eiw12ch128特异性TCR的基因。一种重组逆转录病毒载体，含有SEQ ID NO: 13所示基因。优选的，上述重组逆转录病毒载体的出发载体为pMX-IRES-GFP、pMCs-IRES-GFP或 pMYx-IRES-GFP。上述的重组逆转录病毒载体经包装后得到的逆转录病毒。上述逆转录病毒转染的⑶8+ T细胞。HIV-I肽Eiw12ch128特异性TCR，编码该TCR的基因，含有该基因的重组逆转录病毒载体、逆转录病毒，该逆转录病毒转染的CD8+ T细胞在制备抗艾滋病、艾滋/结核共感染疾病药物中的应用。实现上述技术方案的具体步骤流程如下I、筛选 HIV 肽 Env12Q_128 (KLTPLCVTL)特异的 TCR ①采用淋巴细胞分离液分离HLA-A*0201型健康志愿者外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)； ②计数PBMC，调整PBMC数目为IX IO6/孔，每孔细胞分别加入含HIV肽Eiw12ch12850ng/ml 的 10% FBS-1640 培养基 2ml ； ③培养2h后，加入25U/mlIL-2,第3天补加IL-2至50U/ml，第5天加入IL-2 100U/ml，之后以此浓度继续培养11天； ④磁珠分选出⑶8+T细胞，提取其mRNA，并逆转录为cDNA ；⑤互补决定区3(complementaritydetermining region 3,CDR3)谱型分析检测刺激前后⑶R3谱型，找出刺激后呈单克隆增生的HIV肽Env12Q_128 (KLTPLCVTL)特异的TCR α、β基因家族。2、构建重组逆转录病毒载体 ①根据GeneBank报道的人TCR α、β基因家族上游可变区(variable region,V)和下游恒定区(constant region, C)基因序列，设计TCR α、β链全长基因上、下游引物,扩增出HIV肽特异的TCR α、β全长基因。②设计含TCR α、β链C区下游与⑶3 ζ分子融合位点的重组引物，将HIV肽特异的TCR α、β基因片段与⑶3 ζ分子进行融合。该步骤的目的在于减少内外源 性TCRα、β链的错配，因为⑶8+ T细胞存在内源性TCR α、β基因的表达，通过以⑶3 ζ链替换α、β全长基因部分C本文档来自技高网...
【技术保护点】
HIV？1肽Env120？128特异性T细胞受体（TCR），包括α链和β链，其中，α链的CDR3区含有SEQ？ID？NO:？3所述的序列；β链的CDR3区含有SEQ？ID？NO:？4所示的序列。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：马骊，郝佩佩，温茜，罗微，
申请(专利权)人：南方医科大学，
类型：发明
国别省市：
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