本发明专利技术公开了一种制备端粒酶多肽疫苗GV1001的方法，包括以下步骤：1)由Fmoc-L-Lys(Boc)-OH和固相合成树脂为起始原料，反应得到Fmoc-L-Lys(Boc)-树脂；2)将Fmoc-L-Lys(Boc)-树脂采用Fmoc固相合成方法按GV1001的多肽序列顺序逐一偶联得到侧链基团保护的GV1001-树脂；3）采用裂解试剂裂解侧链基团保护的GV1001-树脂，加入沉淀试剂沉淀得到粗肽；粗肽经过纯化、冻干得到端粒酶多肽疫苗GV1001。本发明专利技术采用的制备端粒酶多肽疫苗GV1001的工艺方法具有实际的工业化应用前景和可观的经济实用价值。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于制药
，尤其是涉及一种制备端粒酶多肽疫苗GV1001的方法。
技术介绍
恶性肿瘤是一种威胁人类生命健康的常见病。目前的手术治疗、放射治疗、药物治疗等方法对一些恶性肿瘤的治疗效果不显著，治后副作用大。研究证实，端粒酶的激活、端粒长度的调节与肿瘤形成有密切的关系，在肿瘤治疗过程中具有高度的特异性。近年来对端粒酶表达与肿瘤形成和发展之间的关系有很多报道，以端粒酶为靶点的肿瘤治疗已经取得良好的进展。1999年，世界专利W000/02581公开了一系列包括GV1001在内的来自端粒酶的抗原多肽。GV1001分子结构式为L_谷氨酰-L-丙氨酰-L-精氨酰-L-脯氨酰-L-丙氨 酰~L_売氨酰-L-売氨酰-L-苏氨酰-L-丝氨酰-L-精氨酰-L-売氨酰-L-精氨酰-L-苯丙氨酰-L-异亮氨酰-L-脯氨酰-L-赖氨酸。GV1001是一种人工合成的端粒酶多肽疫苗，最初由丹麦Pharmexa公司研发，已证实可用于治疗胰腺癌、非小细胞性肺癌和肝细胞性肝癌，目前上述研究分别进入III期临床、II期临床和II期临床，在欧洲和美国均获得治疗胰腺癌的孤儿药地位。GV1001是目前唯一一种进入临床研究的基于端粒酶的HLA (人白细胞相关抗原)-II型多肽疫苗，能同时激活CD4+和CD8+响应。该多肽的结合域能结合多种基于端粒酶的HLA-II型分子和细胞毒T淋巴细胞表位。一些研究结果表明GV1001相关表位能自然的进行免疫原性反应。目前国内外还没有关于GV1001合成工艺方法的详细报道，中国专利CN100376290C提出以固相合成、酶促裂解、重组表达等方法制备，列出了连续流固相肽合成法合成该多肽，采用五氟苯基酯、TBTU或DIC活化，清除剂采用95% TFA,但专利中仅仅简单介绍了一种通用的固相多肽合成方法，未提供详细的技术过程，未列出产品纯度、产率等重要数据。本专利首次详细批露该多肽的固相合成方法及相应的产品信息，优选采用TFA用量更小的切割试剂，对环境更为友好，该方法能用于工业化生产制备。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一条适当的Fmoc固相合成法合成端粒酶多肽疫苗GV1001的路线，有利于工业化生产，成本低、操作方便、对环境影响小、收率高。为实现上述目的，本专利技术采取以下技术方案 一种制备端粒酶多肽疫苗GV1001的方法，其特征在于，包括以下步骤 1)由Fmoc-L-Lys(Boc)-OH和固相合成树脂为起始原料，反应得到Fmoc-L-Lys (Boc)-树脂； 2)将Fmoc-L-Lys(Boc)-树脂采用Fmoc固相合成方法按端粒酶多肽疫苗GV1001的多肽序列逐一偶联得到含侧链保护基团的GV1001-树脂；3)裂解含侧链保护基团的GV1001-树脂，纯化、冻干得到端粒酶多肽疫苗GV1001。其中所述固相合成树脂包括但不限于CTC树脂、WANG树脂或HMPA树脂。所述固相合成树脂担载量为O. I mmol/g-1. 6 mmol/g,优选树脂担载量为O. 5mmoI /g-1. O mmol/g。其中，所述的步骤I为Fmoc-L-Lys (Boc) -OH和CTC树脂在有机碱的作用下，在反应溶剂中生成Fmoc-L-Lys (Boc) -CTC树脂；所述的有机碱包括TMP、NMM或DIPEA ;所述的反应溶剂包括NMP和/或DMF。所述的步骤I也可以采用Fmoc-L-Lys (Boc) -OH在催化剂和偶联剂存在下，在反应溶剂中和WANG树脂或HMPA树脂生成Fmoc-L-Lys (Boc) -WANG树脂或Fmoc-L-Lys (Boc) -HMPA树脂；所述的催化剂为DMAP，所述的偶联剂包括DCC、DIC、DBC、DCC/HOBt、DIC/HOBt、HATU/HOAt/ 有机碱、HBTU/HOBt/ 有机碱、TBTU/HOBt/ 有机碱或 PyBOP/HOBt/有机碱；所述的反应溶剂包括NMP和/或DMF ;所述的有机碱包括TMP、NMM或DIPEA。 所述的步骤2中，Fmoc-L-Lys (Boc)-树脂经过重复的脱保护及与各Fmoc·保护氨基酸在反应溶剂中在偶联剂和有机碱的作用下偶联，生成侧链基团保护的GVlOOl-树脂；所述的偶联剂包括 DCC/HOBt、DIC/HOBt、PyBOP/HOBt/ 有机碱、HBTU/HOBt/有机碱、HATU/HOAt/有机碱或TBTU/HOBt/有机碱；所述的有机碱包括TMP、NMM或DIPEA ;所述的反应溶剂包括NMP和/或DMF。Fmoc保护氨基酸依次为Fmoc-L-Pro-OH、Fmoc-L-Ile-OH、Fmoc-L-Phe-OH、Fmoc-L-Arg (Pbf) -OH> Fmoc-L-Leu-OH、Fmoc-L-Arg (Pbf) -OH、Fmoc-L-Ser (tBu)-OH、Fmoc-L-Thr (tBu)-OH、Fmoc-L-Leu-OH、Fmoc-L-Leu-OH、Fmoc-L-Ala-OH、Fmoc-L-Pro-OH、Fmoc-L-Arg (Pbf) -0H> Fmoc-L-Ala-OH、Fmoc-L-Glu(OtBu)-OH。所述步骤3中，裂解含侧链保护基团的GVlOOl-树脂采用的裂解试剂为TFA/H20、TFA/H20/TIS、TFA/thioanisole/anisole/EDT 或 TFA/thioanisole/H20/phenol/EDT ；优选体积比为 90/5/3/2 的 TFA/thioanisole/anisole/EDT，或体积比为 82. 5/5/5/5/2. 5 的TFA/thioanisole/H20/phenol/EDT。 更具体的，本专利技术所述的制备方法优选包括如下步骤 所述的步骤I :将CTC树脂置于反应器中，经NMP和/或DMF洗涤溶胀；在相当于CTC树脂担载量O. 5-2倍量的Fmoc-L-Lys(Boc)-OH中加入体积为足以溶解上述溶质的NMP和/或DMF，完全溶解后再加入相当于Fmoc-L-Lys (Boc) -OH用量4倍量的DIPEA，混合后一起投至反应器中反应O. 5-10h,反应结束后产物经甲醇、NMP和/或DMF洗涤得Fmoc-L-Lys (Boc) -CTC 树脂。或所述的步骤I为将WANG树脂或HMPA树脂置于反应器中，经NMP和/或DMF洗涤溶胀；在相当于WANG树脂或HMPA树脂担载量I. 5-10倍量的Fmoc-L-Lys (Boc) -OH中加入相当于WANG树脂或HMPA树脂担载量I. 5-10倍量的偶联剂，并加入体积为足以溶解上述溶质的NMP和/或DMF，完全溶解后加入反应器；并将相当于WANG树脂或HMPA树脂担载量O. 01-0. 2倍量的DMAP加至反应器中反应l_20h ;所述的偶联剂包括DCC、DIC、DBC、DCC/HOBt、DIC/HOBt、HATU/HOAt/ 有机碱、HBTU/HOBt/ 有机碱、TBTU/HOBt/ 有机碱或 PyBOP/HOBt/有机碱；所述的有机碱为TMP、NMM或DIPEA ;反应结束后产物经甲醇、NMP和/或DMF洗漆得 Fmoc-L-Lys (Boc) -WANG 树脂或 Fmoc-L-Ly本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种制备端粒酶多肽疫苗GV1001的方法，包括以下步骤:1)？由Fmoc？L？Lys(Boc)？OH和固相合成树脂为起始原料，反应得到Fmoc？L？Lys(Boc)？树脂；2)？将Fmoc？L？Lys(Boc)？树脂采用Fmoc固相多肽合成方法按端粒酶多肽疫苗GV1001的多肽序列逐一偶联得到侧链基团保护的GV1001？树脂；3)？裂解侧链基团保护的GV1001？树脂，纯化、冻干得到端粒酶多肽疫苗GV1001；其中：所述固相合成树脂包括但不限于CTC树脂、WANG树脂或HMPA树脂；所述端粒酶多肽疫苗GV1001的序列为：H？L？Glu？L？Ala？L？Arg？L？Pro？L？Ala？L？Leu？L？Leu？L？Thr？L？Ser？L？Arg？L？Leu？L？Arg？L？Phe？L？Ile？L？Pro？L？Lys？OH。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：朱颐申，周云隆，韦萍，欧阳平凯，
申请(专利权)人：南京工业大学，
类型：发明
国别省市：
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